欧夹竹桃甙丙的检测及应用

背景及概述^[1][2]

欧夹竹桃甙丙是一种欧夹竹桃甙丙科的常绿灌木或小乔木，具有观赏价值。欧夹竹桃甙丙因其毒性而闻名，也是世界上最毒的植物之一，人类和家畜因欧夹竹桃甙丙中毒甚至死亡的案（事）件时有报道。摄入欧夹竹桃甙丙会产生典型的强心苷中毒临床症状，主要表现为胃肠道不适、恶心和呕吐，其次为神经系统症状，包括虚弱、精神错乱和心脏症状，通常表现为由于传导问题引起的心动过缓和房室传导阻滞导致纤颤。

检测^[1]

LC-MS/MS测定血液、肝组织中的欧欧夹竹桃甙丙苷：

目前对体内欧欧夹竹桃甙丙苷的检测方法主要有薄层色谱法、荧光分光光度法、 高效液相色谱法和质谱法。液相色谱-串联质谱法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）结合了液相色谱分离效率高和质谱化合物鉴定功能强的优点，是分析生物样品中复杂和难以挥发的强心苷的理想方法。

实验方法：

1. 溶液配制

称取对照品欧欧夹竹桃甙丙苷 10 mg 于 10 mL 容量瓶中，精密称定，加入甲醇溶解，稀释，定容，配制成质量浓度为1 mg/mL的欧欧夹竹桃甙丙苷甲醇储备液，置于冰箱中冷冻保存，待用。实验中所用其他浓度的对照品溶液均由上述对照品储备液稀释而得。

2 样品前处理方法

取血液1mL或肝组织（已研磨成匀浆）1g，用2mL乙醚进行提取， 涡旋混合3 min，以离心半径 12 cm，2500 r/min，离心 3 min。将上清液转移至另一试管中，水浴 60℃下挥干。残留物中加入200 μL甲醇复溶，供LC-MS/MS分析。

3仪器条件

色谱条件：色谱柱为 Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，5μm），前接 Phenomenex保护柱；以20 mmol/L 乙酸铵（含0.1%甲酸）溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。梯度洗脱程序见表1。流速：0.2 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10μL。

质谱条件：采用电喷雾正离子化（ESI⁺），多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式检测；离子源电压（IS）4 500 V，气帘气（CUR）25 psi， 雾化气（GS1）35 psi， 辅助气（GS2）40 psi，离子源温度（TEM）500 ℃。

选用欧欧夹竹桃甙丙苷的两对母离子-子离子对进行定性分析，分别为 m/z 577.4/373.3、 m/z 577.4/355.3，将离子对m/z 577.4/373.3作为定量离子对。

应用 ^[2]

DNA双链断裂是最严重的DNA损伤形式。如果得不到有效的修复，将会导致细胞的死亡。DNA双链断裂损伤修复主要利用同源重组和非同源性末端接合(Non-homologous end joining,NHEJ)机制。同源重组在其中起主要作用，通过利用未受损伤的另一条染色体作为模版，来修复与其相似的受损伤的染色体；非同源性末端接合的修复方式属于不精确修复，所产生的DNA往往导致基因组不稳定而最终引起细胞死亡。参与同源重组修复的基因包括RAD51、RAD54、BRCA1、BRCA2等。RAD51是有丝分裂细胞中催化DNA同源重组修复过程中同源配对的唯一因子。而XRCC1是非同源末端接合修复的主要因子。因此，本领域迫切需要研发能够有效诱导肿瘤细胞DNA双链断裂损伤、肿瘤细胞凋亡的相关药物。

CN201510511959.6提供一种能够有效诱导肿瘤细胞DNA双链断裂损伤、肿瘤细胞凋亡的相关药物。在本发明的方面，提供了一种欧欧夹竹桃甙丙苷或其药用盐的用途，其特征在于，用于制备(i)用于抑制DNA修复；(ii)用于降低肿瘤细胞的耐药性的组合物或制剂。

在本发明的第二方面，提供一种非治疗性的、体外抑制DNA修复的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将待处理的细胞与欧欧夹竹桃甙丙苷或其药学上可接受的盐接触，从而抑制所述细胞中的DNA修复。

在本发明的第三方面，提供一种非治疗性的、体外降低肿瘤细胞耐药性或耐受性的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将所述的肿瘤细胞与欧欧夹竹桃甙丙苷或其药学上可接受的盐接触，从而降低肿瘤细胞耐药性或耐受性。图1显示了欧欧夹竹桃甙丙苷能够有效诱导肿瘤细胞凋亡。

主要参考资料

[1] 翟金晓,严慧,沈敏,沈保华,刘伟.LC-MS/MS测定血液、肝组织中的欧欧夹竹桃甙丙苷[J].法医学杂志,2018,34(06):585-589.

[2] CN201510511959.6 一种新型同源重组抑制剂