焦磷酸测序技术

焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是由Ronaghi等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术，其核心是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应。焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高，可以进行DNA甲基化、SNP等单个/连续多个核苷酸变异等检测。

一、焦磷酸测序技术原理

焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。4种酶分别为：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，反应底物为5′-磷酰硫酸(APS)、荧光素，反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列目的。

二、焦磷酸测序基本过程

首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。PCR产物和偶联亲和素(avidin)的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开，纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。具体测序反应的过程为：

（1）将测序引物杂交到PCR扩增的模板上，然后加入DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶及其反应底物：5′-磷酰硫酸(APS)、荧光素组成一个反应体系共孵育。

（2）在每一轮测序反应中，只能加入4种dNTP(dATPαS、dTTP、dCTP、dGTP)之一，如该dNTP与待测模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中，并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。需要说明的是，在焦磷酸测序过程中，dATP能被荧光素酶分解，对后面的荧光强度测定影响很大，而dATPαS对荧光素酶分析的影响比dATP低500倍。因此在焦磷酸测序中用dATPαS(S原子取代了dATP分子αP=O上O原子)代替自然状态下的dNTP。

（3）硫酸化酶催化APS和PPl形成等摩尔数的ATP。ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxy-luciferin)转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄影机检测并由Pyro-gram反应为峰。峰的高度(光信号强度)与反应中掺入的核苷酸数目成正比。

（4）ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。然后就可以加入下一种dNTP。

（5）随着以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列由Pyrogram的信号峰确定。通过信号峰的有无判断碱基的种类，用信号峰的峰高来判断碱基的数目。

三、焦磷酸测序的应用

1、在病原微生物快速鉴定中的应用

传统的细菌分离、培养和生化分析，已不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学研究，研究者不仅希望在分子水平上对各种细菌和病毒进行研究，同时希望检验方法更快速、准确，通量更高，人为影响因素要尽可能减少，便于构建标准化的操作流程。PCR以及定量PCR的方法无法获得分子诊断的黄金标准-基因序列，而利用常规的DNA测序技术对大片段的DNA进行序列测定，在速度和消耗上不能满足对大规模样本快速检测的要求。在实际工作中，很短的一段保守/特异序列的测定就可满足对分子诊断的需要。焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，通量高、操作方便，便于构建标准化操作流程。

2、在单核苷酸多态性研究方面的应用

SNP是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换(C与T互换，在其互补链上则为G与A互换)或颠换(C与A、G与T、C与G、A与T互换)等变异所引起的DNA序列多态性。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上，在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。人类基因组单核苷酸多态性研究所揭示的人种、人群和个体之间DNA序列的差异以及这些差异所表现的意义，将对疾病的诊断、治疗和预防带来革命性的变化。SNP可以用于疾病的遗传连锁分析及关联分析，用于疾病易感基因定位，而且其定位的精度将比微卫星标记精细得多，可直接用于指导易感基因克隆。还可通过检测SNP的遗传多态性标记，揭示人群中不同个体对不同药物的敏感性差异的根本原因。另外，也可用于法医研究罪犯身份的鉴别及亲子鉴定等。

3、在DNA甲基化研究方面的应用

在表观遗传学的DNA甲基化研究中，新一代的测序方法可得到大量的全基因组甲基化特征数据，需要验证其中特定靶序列与表观遗传修饰的生理相关性。此验证过程较具挑战性，因为甲基化位点的位置和频率的微小改变也会带来明显的变化。焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点，是理想的验证方法。因此该技术在表观遗传学研究中逐渐成为数据分析的金标准。