G422细胞的应用

背景^[1-3]

G422细胞是1964年建株；甲基胆蒽植入Km小鼠脑内诱发星形细胞瘤，传至第120代后转为胶质细胞瘤；瘤细胞悬液同系小鼠皮下、肌肉、脑内移植，成功率皆100%。肌肉及脑内移植可形成较规律的移植性瘤株，存活时间脑内型15.9±4.8天；肌肉型20.3±6.6天。

G422细胞

G422小鼠神经胶质瘤细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

G422细胞是可以用于腺病毒介导的小鼠内皮抑素基因治疗G422胶质母细胞瘤的实验

重组腺病毒的制备及其对肿瘤细胞、内皮细胞生长的作用目的：制备高浓度、高纯度携有小鼠内皮抑素基因的重组腺病毒，测定该病毒体外对效应细胞的转染率，明确转染后肿瘤细胞能够表达内皮抑素，观察携有目的基因的重组腺病毒转染后对肿瘤细胞及内皮细胞体外培养时生物学特性变化。

方法和结果：(一)Ad-mEnd和Ad-GFP用293细胞扩增，经氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩后，TCID50法测得最终病毒滴度分别为5.01×1010 pfu／ml和3.16×1010pfu／ml；并用Ad-GFP测得本腺病毒对G422细胞的体外转染率，在MOI=100时即可达到90％以上。

(二) Ad-mEnd转染G422细胞培养后，RT-PCR检测到在540bp位置有高亮度条带表达，定量为β-Actin的5倍，测序结果为End基因；在转染细胞的上清液中，Western blot试验方法能够检测到20KD的蛋白质表达，证实End蛋白质表达。

(三) 消化分离法分离和培养G422小鼠胶质母细胞瘤，使之形成单细胞悬液，在高糖DMEM培养液中可存活数代，细胞悬浮生长，不贴壁；差速离心法成功提取脑微血管内皮细胞，细胞贴壁后呈铺路石样生长，在体外长期培养传代。

(四)G422、BMEC、ECV细胞转染Ad-mEnd后，MTT法检测BMEC和ECV的细胞生长抑制率分别为95％和78％，G422组转染Ad-mEnd后细胞生长正常；分别用流式细胞仪测定了不同转染时间后Ad-mEnd对G422、BMEC和ECV凋亡的影响，发现内皮细胞系在24小时内即可出现明显大批细胞凋亡，48小时到60小时达到高峰，细胞周期分析图上可以见到明显的调亡峰，Gl期细胞比率增加;G422细胞在分别转染Ad一mEnd、Ad一GFP、PBS后观察60小时，各时间段均未出现细胞凋亡现象，细胞周期捡测结果显示细胞各期生长正常，无凋亡峰出现。

参考文献

[1]Clinical Trials with Retrovirus Mediated Gene Therapy–what Have we Learned?[J].Nikolai G.Rainov;;Huan Ren.Journal of Neuro-Oncology,2003(3)

[2]Anti-angiogenic Treatment Strategies for Malignant Brain Tumors[J].Matthias Kirsch;;Gabriele Schackert;;Peter McL.Black.Journal of Neuro-Oncology,2000(1)

[3]Intravenous delivery of an endostatin gene complexed in cationic lipid inhibits systemic angiogenesis and tumor growth in murine models[J].Paul Blezinger;;Guoyong Yin;;Liang Xie;;Jijun Wang;;Majed Matar;;Jeffrey S.Bishop;;Wang Min.Angiogenesis,1999(3)

[4]AngiostatinTM and EndostatinTM:endothelial cell-specific endogenous inhibitorsof angiogenesis and tumor growth[J].B.Kim Lee Sim.Angiogenesis,1998(1)

[5]尹嘉.腺病毒介导的小鼠内皮抑素基因治疗G422胶质母细胞瘤的实验[D].第二军医大学,2004.