大鼠前列腺酸性磷酸酶(PAP)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠前列腺酸性磷酸酶(PAP)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中前列腺酸性磷酸酶(PAP)的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被前列腺酸性磷酸酶(PAP)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠前列腺酸性磷酸酶(PAP)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

大鼠前列腺酸性磷酸酶(PAP)ELISA试剂盒用于免疫组化五项指标（PSA、PAP、HCK、P63、AMACR）的表达在前列腺病变诊断中的应用价值研究

统计分析PSA、PAP、HCK、P63、AMACR的表达,以探讨其在前列腺病变诊断中的实际应用价值

方法：选取经病理组织形态学确诊的前列腺病人121例,年龄56-86岁,平均67岁。其中前列腺癌病人63例,非前列腺癌组病人58例.非前列腺癌组中,BPH、IGPIN、HGPIN、AAH分别为31例、17例、4例、6例。前列腺癌组病人中,按照Gleason分级标准,5-6分13例、7分23例、8-9分27例。所有前列腺组织标本,均经PSA、PAP、HCK、P63、AMACR五项指标免疫组化染色。

结果1、回归方程建立的数学模型可以准确的对前列腺良恶性病变的性质作出科学的诊断5项免疫组化指标中HCK、P63、AMACR被引入方程,对良恶性的鉴别诊断有明显的影响。

2、PSA和PAP均显示了其在前列腺组织中的高敏感性：PSA:91.7%（111/121）、PAP:94.2%（114/121）;前列腺良恶性组织中PSA表达与PAP的表达间无相关性（P＞0.05）。

3、HCK、P63两者在三种前列腺良性病变中均显示了高表达,而在前列腺癌组中则低表达；均可作为基底细胞标记物。HCK比P63更敏感和特异,可以将HCK作为首选抗体。

4、AMACR显示了在前列腺癌组中的高表达,而在三种前列腺良性病变中均低表达。

5、AMACR与基底细胞首选抗体HCK联合应用,可以提高诊断准确率。

6、5种标记物染色阳性在Gleason评分三组间表达无统计学差异。

结论1、可以将HCK作为基底细胞标记物的首选抗体；对于组织形态学诊断有困难病例,建议将HCK+AMACR作为常规标记物。

2、不建议将PSA和PAP作为常规使用的标记物,仅在临床及组织形态学指向有异常时,选用组织特异性标记物。

3、PSA、PAP、HCK、P63、AMACR表达阳性和Gleason评分之间无相关性,5项指标对恶性程度的评价,及预后评估没有价值。

参考文献

[1]Prostate cancer and chronic prostatitis[J].Jaspreet S.Sandhu.Current Urology Reports.2008(4)

[2]Immunohistochemical Stains for p63 andα-Methylacyl-CoA Racemase,Versus a Cocktail Comprising Both,in the Diagnosis of Prostatic Carcinoma:A Comparison of the Immunohistochemical Staining of 430 Foci in Radical Prostatectomy and Needle Biopsy Tissues[J].Omar Hameed,Jack Sublett,Peter A Humphrey.The American Journal of Surgical Pathology.2005(5)

[3]How Often Does Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase Contribute to Resolving an Atypical Diagnosis on Prostate Needle Biopsy Beyond That Provided by Basal Cell Markers?[J].Ming Zhou,Hakan Aydin,Hillel Kanane,Jonathan I Epstein.The American Journal of Surgical Pathology.2004(2)

[4]Prostatitis as a Risk Factor for Prostate Cancer[J].Rosebud O.Roberts,Erik J.Bergstralh,Sarah E.Bass,Michael M.Lieber,Steven J.Jacobsen.Epidemiology.2004(1)

[5]曹亮.免疫组化五项指标（PSA、PAP、HCK、P63、AMACR）的表达在前列腺病变诊断中的应用价值[D].中南大学,2010.