肠致病性大肠杆菌抗体的应用

背景^[1-3]

肠致病性大肠杆菌抗体是一类可以特异性结合肠致病性大肠杆菌的多克隆抗体，主要用于体外检测肠致病性大肠杆菌的免疫学实验。

肠致病性大肠杆菌即大肠埃希氏菌(E.coli)，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。

肠致病性大肠杆菌

大肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群。但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。

大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内。它侵入人体一些部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。

大肠细菌（E.coli）为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。一般多不致病，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，统称致病性大肠杆菌。

该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。

应用^[4][5]

用于仔猪肠致病性大肠杆菌的分离、鉴定及其菌毛抗体间接ELISA检测方法的建立与应用研究

肠致病性大肠杆菌（ETEC）是引起新生仔猪腹泻的主要病原。本研究从江苏和江西两省部分地区的规模化猪场发生腹泻的新生仔猪中分离得到携带菌毛基因的大肠杆菌并对菌毛基因型的分布特征进行了分析。利用基因工程技术在大肠杆菌中分别表达了F4、F5、F6菌毛亚单位基因faeG、fanC、fas A并验证了重组菌毛蛋白的免疫原性。以纯化的重组F4菌毛蛋白作为检测抗原建立了间接ELISA方法,并初步应用于临床检测。

本文研究内容如下：1仔猪肠致病性大肠杆菌的分离和鉴定2012年10月至2013年9月间,从江苏、江西2省部分地区的13家猪场采集临床疑似新生仔猪腹泻粪样146份,从中分离、鉴定出116株大肠杆菌。根据GenBank发表的大肠杆菌F4、F5、F6菌毛的基因序列分别设计特异性引物,对116株致仔猪肠致病性大肠杆菌的菌毛基因进行PCR检测。结果有20株（17%）大肠杆菌检测出F4菌毛基因,6株（5.2%）检测出F5菌毛基因,19株（16%）检测出F6菌毛基因,有5株（4.3%）大肠杆菌同时检测出2种菌毛基因。通过溶血性试验发现,有13株（10%）大肠杆菌完全溶血,6株（5.2%）不完全溶血。通过分析菌毛类型与溶血性之间的相关性作为评判大肠杆菌致病性的重要指标。

2肠致病性大肠杆菌F4、F5和F6菌毛亚单位基因的克隆表达为了实现肠致病性大肠杆菌F4、F5和F6菌毛亚单位基因的体外表达,为诊断试剂盒及基因工程疫苗的研制提供材料基础,本研究将去除信号肽序列的faeG、fanC、fasA基因序列克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-faeG、pET-28a-fanC、pET-28a-fasA并经PCR及双酶切鉴定构建正确后分别转化至E.coliBL21中。经IPTG诱导表达的F4、F5、F6菌毛亚单位蛋白相对分子质量分别为27l（I）a、20kDa、22kDa,表达产物主要以包涵体形式存在。经Ni-Agarose His纯化和复性后进行Western-blot分析,确定所得蛋白抗原性良好。

3肠致病性大肠杆菌F4菌毛抗体间接ELISA检测方法的建立及作用为建立检测产肠毒素大肠杆菌F4菌毛抗体的方法,本研究以纯化的重组F4菌毛蛋白免疫新西兰长耳兔制备免疫血清,并以重组F4菌毛蛋白作为检测抗原建立了间接ELISA方法并对该方法的反应条件进行了优化。

确定ELISA条件为：包被抗原浓度为35 ng/mL;50 g/L脱脂奶粉封闭液封闭2 h；血清稀释度为1：3200；血清作用时间为1 h；酶标二抗的作用时间为1 h。经试验验正,该方法具有特异性好、重复性好、稳定性强等特点。利用建立的间接ELISA方法与PCR方法进行符合性试验得出总符合率为96.2%。临床检测312份未经ETEC免疫的猪血清,阳性检出率为9.9%。

参考文献

[1]Real-time PCR for differentiation of F4（K88）variants（F4ab,F4ac,F4ad）of enterotoxigenic Escherichia coli from diarrhoeic piglets[J].Jae-Won Byun,Byeong Yeal Jung,Ha-Young Kim,John M.Fairbrother,Wan-Kyu Lee.The Veterinary Journal.2012(2)

[2]Avirulent K88（F4）+Escherichia coli strains constructed to express modified enterotoxins protect young piglets from challenge with a virulent enterotoxigenic Escherichia coli strain that expresses the same adhesion and enterotoxins[J].Kristina Santiago-Mateo,Mojun Zhao,Jun Lin,Weiping Zhang,David H.Francis.Veterinary Microbiology.2012(3-4)

[3]ETEC vaccination in pigs[J].Vesna Melkebeek,Bruno M.Goddeeris,Eric Cox.Veterinary Immunology and Immunopathology.2012

[4]Role of Antimicrobial Selective Pressure and Secondary Factors on Antimicrobial Resistance Prevalence in Escherichia coli from Food-Producing Animals in Japan[J].Kazuki Harada,Tetsuo Asai,John E.Degener.Journal of Biomedicine and Biotechnology.2010

[5]杨绪秋.仔猪肠致病性大肠杆菌的分离、鉴定及其菌毛抗体间接ELISA检测方法的建立与应用[D].南京农业大学,2014.