碘化丙啶的应用

背景及概述

碘化丙啶是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。

应用 ^[1-3]

一、用于制备快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒

目前测定活细胞数的方法有光学显微镜读数计数法、平板涂布培养菌落计数法、光电比浊法、或然数法，以及膜过滤法等。显微镜直接计数法：将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接观察计数。该方法简便、快速、直观，可以用于酵母、细菌、霉菌孢子和动物细胞等悬液的计数。缺点为不能准确识别细胞的死活状态，所测得的结果通常是死细胞和活细胞的总和。

CN201310060140.3提供一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒及其应用，该试剂盒可以快速实时地观察或者检测样品中各种细胞的活细胞与死细胞的数量，直观简便，排除了其它物质的干扰和培养周期长的缺点，不仅适用于动物细胞，并且还适用于大部分的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。

本发明的一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒，所述试剂盒包括花青素染料和碘化丙啶染料，花青素染料的储存浓度为5-6mM，碘化丙啶染料的储存浓度为100 μg/mL。所述花青素染料所使用的稀释缓冲液为1×TEbuffer[含1mMEDTA（乙二胺四乙酸）的 10mMTris-HCl（三羟甲基氨基甲烷-HCl）缓冲液，pH8.0]。这种染料能渗透到所有状态下的细胞，它倾向于结合细胞内双链DNA，对于单链DNA和RNA的结合较少，对细胞的核酸进行染色，使细胞发出绿色荧光。

检测步骤如下：在细胞悬液中加入试剂盒中的花青素染料和碘化丙啶，利用荧光显微镜观察计数或者利用微孔 荧光读板器在发射光波长下进行检测，根据不同颜色荧光值的强弱反映生物样品液中细胞的存活状态。本发明可以快速实时地观察或者检测样品中各种细胞的活细胞与死细胞的数量，直观简便。并且花青素染料来源于自然界，毒性低，便于使用。

由于染料只能专一性地结合在双链 核酸上发出荧光，排除了其它物质的干扰和培养周期长的缺点。此染色方法不仅适用于动物细胞，并且还适用于大部分的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。

二、用于制备精子活力快速检测试剂盒

CN200710099772.5提供一种可以在家里即可操作、快速、使用方便、价格便宜，并且能诊断出有活力的精子的数量的精子活力快速检测试剂盒。本发明包括精液收集盒、曲拉通X100溶液、碘化丙啶溶液、标准色卡和试验板，所述的精液收集盒由塑料收集盒和精液液化剂组成，所述的试验板包括外壳、基板，外壳和基板是长方形的PVC塑料制成，外壳中央有两个试验孔，所述基板上有吸水纸、过滤膜，吸水纸和过滤膜位于基板上方，外壳的两个试验孔下方；吸水纸位于过滤膜下方；标准色卡的颜色为经显微镜计数确认的不同活力精子样品分别加入活力为0.05-0.2％的曲拉通溶液和活力为0.01-0.5％碘化丙啶溶液试验结果的颜色。

本发明的原理是：只有没有活力的精子才会被碘化丙啶溶液染色，所以在试验孔一被染色的精子全部为没有活力的精子，而试验孔二的精子经过细胞表面活性剂曲拉通X-100溶液破坏后，全部变成没有活力的精子，所以在试验孔二被染色的精子为精子的总数量，把试验孔一和试验孔二的试验结果分别与比色卡对比，得出没有活力的精子的数量和精子的总数量，用精子的总数量减去没有活力的精子的数量，即可得出有活力的精子的数量。

制备方法，包括如下步骤：

制备浓度为0.05-0.2％的曲拉通溶液：把曲拉通加入磷酸缓冲液充分溶解，过滤后置室温保存；

制备浓度为0.01-0.5％碘化丙啶溶液：把碘化丙啶加入磷酸缓冲液充分溶解，过 滤后置室温避光保存；

制备标准色卡：用经过显微镜计数确认的500万、1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万、10000万个/毫升精子样品分别加入浓度为0.05-0.2％的曲拉通溶液和浓度为0.01-0.5％碘化丙啶溶液，根据试验结果的颜色，制备出标准色卡；

将过滤膜和吸水纸依次置于基板上方，试验孔下方。

本发明的优点：能够快速准确地检测出精子的活力，即有活力的精子的数量，从而诊断出男性是否能够生育后代，比以往传统的诊断方法节省很多时间，使用简单，在药店购买、家庭使用即可，不用去医院就诊，使使用者没有羞涩感，使夫妻可以提前知道自己的潜在的生育问题，使用本试剂盒还可以对男子绝育手术后效果进行检测，也可用于精子库对精子质量进行筛选。

三、用于制备一种染色液

CN200710026446.1提供一种用于鉴别原虫细胞活力的染色液，包括如下组分：0.05％-0.3％吖啶橙溶液3份；0.0067％-0.026％碘化丙啶溶液1份，所述吖啶橙溶液、碘化丙啶溶液是由0.38％NaCl 溶液或双蒸水配制而成。

使用所述染色液鉴别原虫细胞活力的方法，包括如下步骤：

(1)取材：提供原虫细胞，备用；

(2)配制染色液：将0.05％-0.3％吖啶橙溶液和0.0067％-0.026％碘化丙啶溶液按3∶1混合，过滤备用；

(3)染色：将原虫细胞涂片阴干，用步骤(2)提供的染色液染色，双蒸水缓慢冲洗，干燥；

(4)镜检：于490nm激发滤光片和510nm光栅滤光片荧光显微镜下观察；

(5)鉴别：根据镜检结果的颜色变化鉴别原虫细胞活力。

本发明对鉴别家蚕微孢子虫孢子的活性，具有快捷、灵敏、准确、直观的特点，克服了现有技术的不足。鉴于家蚕微粒子病长期严重威胁蚕种生产，采用本发明鉴别家蚕微孢子虫的活力技术，对蚕业生产有重大的生产应用价值，对进一步深入研究家蚕微粒子虫的传染规律、微粒子病的发病规律、微粒子病防治技术、微孢子虫消毒和治疗药物筛选等有重要意义。本发明也为昆虫学、医学、畜牧兽医学等其他原虫研究领域提供很好的借鉴作用。

主要参考资料

[1] CN201310060140.3 快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒及其应用

[2] CN200710099772.5 精子活力快速检测试剂盒及其制备和使用方法

[3] CN200710026446.1 一种染色液及其染色方法和应用