小鼠血红素氧合酶1(HO-1)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠血红素氧合酶1(HO-1)ELISA KIT用于体外定量检测小鼠血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中血红素氧合酶1（HO-1）的含量。

检测原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠血红素氧合酶1（HO-1）水平。用纯化的小鼠血红素氧合酶1（HO-1）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入血红素氧合酶1（HO-1），再与HRP标记的血红素氧合酶1（HO-1）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血红素氧合酶1（HO-1）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠血红素氧合酶1（HO-1）浓度。

小鼠血红素氧合酶1(HO-1)ELISA KIT

操作步骤

1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在*、第二孔中分别加标准品100μl，然后在*、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从*孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为1800ng/L,1200ng/L,600ng/L,300ng/L,150ng/L）。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于氢气通过上调HO-1的表达减轻脓毒症小鼠肺损伤研究

探讨氢气吸入对脓毒症小鼠肺组织HO-1表达的影响,为明确其治疗机制提供参考。

方法:成年雄性ICR小鼠,体重20~25 g,6周龄,随机分为6组:假手术组（sham）,假手术+H2吸入组（sham+H2）,重度脓毒症组（severe sepsis）,重度脓毒症+H2吸入组（severe sepsis+H2）,重度脓毒症+ZnPPIX组（severe sepsis+ZnPPIX）,重度脓毒症+H2吸入+ZnPPIX组（severe sepsis+H2+ZnPPIX）。采用盲肠结扎穿孔（CLP）的方法建立重度脓毒症小鼠模型。H2吸入方案为在假手术或CLP术后1 h和6 h分别给予2%H2吸入1 h,余下三组吸入气体为空气。severe sepsis+ZnPPIX组及severe sepsis+H2+ZnPPIX组在CLP术前1 h给予ZnPPIX腹腔注射,剂量为40mg/kg。部分:取120只小鼠,采用随机数字表法,将其分为上述6组（n=20）。

观察各组小鼠不同时间点（1,2,3,5,7天）的生存率。另取108只小鼠随机分为上述6组（n=18）。于CLP术后6 h、12 h及24 h分别处死小鼠,测定各个时间点各组小鼠血清及肺组织匀浆中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）及白细胞介素10（IL-10）的水平。

观察各组小鼠术后24 h肺组织病理学改变,肺湿/干（W/D）重比及氧合指数（PaO2/FiO2）的变化。

另取108只小鼠随机分为6组（n=18）。于CLP术后6 h、12 h及24 h分别处死小鼠,采用Western blot免疫印迹法观察各个时间点各组小鼠肺组织中HO-1、HMGB1以及Nrf2蛋白的表达;采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）法测定小鼠肺组织HO-l mRNA、HMGB1 mRNA以及Nrf2 mRNA的表达;采用胆红素生成法测定小鼠肺组织中HO-1的活性。

最后,用免疫荧光的方法观察CLP术后24 h小鼠肺组织中HMGB1表达的变化。

结果:假手术组及假手术+H2吸入组小鼠生存率为100%。在重度脓毒症组小鼠中,小鼠生存率由24 h的85%降至48 h的40%;氢气吸入可提高重度脓毒症小鼠的7 d生存率（P＜0.05）;而使用ZnPPIX后,小鼠生存率降低（P＜0.05）。与假手术组相比,重度脓毒症小鼠肺组织病理学评分、W/D比值增加,PaO2/FiO2降低（P＜0.05）,氢气吸入可明显缓解这些变化（P＜0.05）,使用ZnPPIX后,肺组织损伤加重（P＜0.05）;此外,氢气治疗可显著降低重度脓毒症小鼠血清和肺组织促炎因子TNF-α及HMGB1水平（P＜0.05）,提高抗炎因子IL-10水平;而使用ZnPPIX后,TNF-α及HMGB1水平升高,IL-10水平降低（P＜0.05）。

参考文献

[1]Lung inflation with hydrogen during the cold ischemia phase decreases lung graft injury in rats[J].Rongfang Liu,Xianhai Fang,Chao Meng,Jingchun Xing,Jinfeng Liu,Wanchao Yang,Wenzhi Li,Huacheng Zhou.Experimental Biology and Medicine.2015(9)

[2]Inhalation of hydrogen gas attenuates brain injury in mice with cecal ligation and puncture via inhibiting neuroinflammation,oxidative stress and neuronal apoptosis[J].Lingling Liu,Keliang Xie,Hongguang Chen,Xiaoqing Dong,Yuan Li,Yang Yu,Guolin Wang,Yonghao Yu.Brain Research.2014

[3]Epidemiology of severe sepsis[J].Florian B Mayr,Sachin Yende,Derek C Angus.Virulence.2014(1)

[4]Heme oxygenase-1 mediates the anti-inflammatory effect of molecular hydrogen in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages[J].Hong-Guang Chen,Ke-Liang Xie,Huan-Zhi Han,Wei-Na Wang,Da-Quan Liu,Guo-Lin Wang,Yong-Hao Yu.International Journal of Surgery.2013(10)

[5]李媛.氢气通过上调HO-1的表达减轻脓毒症小鼠肺损伤[D].天津医科大学,2015.