蛋白酶K的酶活性与配制方法

蛋白酶 K(E. C. 3. 4. 21. 64)是真菌 Tritirachium album Limber 合成的胞外内肤 酶，它是具有典型催化三元组Asp39-His69-Ser 224的丝氨酸蛋白酶类中的一员。蛋白酶K具有高于30U/mg的特异活性，是已知的内肽酶中最有活性的之一，并且非特异性水解天然的和变性的蛋白质。

结构特性

成熟蛋白酶K由279个氨基酸组成，两个二硫桥和两个键合的钙离子使得紧密结构稳定。所以，与其他枯草杆菌蛋白酶相比，蛋白酶K对极端pH值、高温、离液剂和去污剂具有高得多的稳定性，蛋白酶K在高温(达65°C)和宽pH范围（pH 7. 5 -12.0)具有高稳定性。在变性剂例如脲或SDS存在下其活性得以提高。

上述性质使得蛋白酶K在要求非特异性蛋白质降解的生物技术领域中具有很好的应用，特别是从粗提取液中分离核酸（DNA或 RNA)以及在DNA分析中预制备样品，另外蛋白酶K也可应用于蛋白质分析领域，例如结构释析。

酶活性

酵素偏好的切位是在疏水性胺基酸后的位置。本酵素由钙活化，虽然钙并不会影响酵素的活性，但它可使酵素更稳定。

在足量酵素浓度及作用时间的环境下，蛋白质会完全被水解。若移除钙离子，蛋白酶K的稳定性会大幅降低，但其水解活性仍然存在。蛋白酶K对于钙离子具有两个结合位，都在活性中心附近，但都与催化反应无直接关联。

应用

蛋白酶K时常应用于分子生物学领域。在制备核酸时，蛋白酶K可以将杂蛋白去除，并迅速使核酸酶失活，避免其降解目标产物DNA和RNA。另外，蛋白酶K还有其他优点，它在变性剂存在下仍能保有活性，如SDS、尿素、EDTA等等，这点与其他蛋白酶（如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）相当不同。 

使用方法

1. 20-40 mg/mL Proteinase K 储存液的配制

1）将干粉溶解于稀释缓冲液中，配制成 40-80 mg/mL 原液；

【注】：稀释缓冲液配方：20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM CaCl2。

2）使用低蛋白吸附的 0.22 µm 滤器过滤除菌；

3）加入等体积无菌甘油，配制成含 50 %甘油的 Proteinase K 储存液。

【注】：Proteinase K 储存液 4℃保存 1 年。若需反复使用，需分装保存。

2. 按照核酸提取说明书添加指定量 Proteinase K 储存液即可。