九肽-1纯化方法研究

前言

美白化妆品经过多年的发展，从一开始简单物理遮盖增白到对角质层的剥离，再到各种美白成分作用下的协同美白，每一阶段发展都是一次技术革新，现阶段的发展趋势是健康养白。随着美白化妆品研究的深入，消费者对美白化妆品有了新的需求，崇尚自然之美而不是单纯的变白，既要使肌肤美白同时也要保持肌肤的健康，追求美白的同时给肌肤补充营养。目前还没有一种美白活性成分能够多路径抑制黑素的形成，因此，要使得不同美白作用机理的成分相互协同作用，提高化妆品全面的美白功效，这是美白产品流行的主要趋势[1]。

九胜肽 -1 又名美立肽，为含有九个氨基酸的美白九肽，主要用于美白亮肤及祛斑。九肽 -1 是一种仿生肽，它和黑色素细胞上的 MC1受体有非常好的匹配性，因此可以作为促黑色素细胞激素的对抗剂，竞争性的与MC1受体结合，阻止酪氨酸酶进一步被激活而产生黑色素。九肽 -1 竞争性的封闭黑素母细胞上受体与各种因子信号的入口，弱化了黑素母细胞的活性，减少黑素产生量，14 天开始逐步均匀肤色，一个皮肤周期28天后，明显提亮肤色，呈现肌肤红润、白皙，因此九肽-1常被用作化妆品原料。九肽 -1 作为化妆品原料时 HPLC 纯度≥ 99%，然而通过合成得到的九肽 -1 粗品中含有很多杂质，需要进一步提纯后才可以作为化妆品原料。

实验部分

试剂与仪器

乙酸 ( 分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、乙酸钠（分析纯）、氯化钠（分析纯）甲醇（色谱纯)、乙腈（色谱纯）、三氟乙酸（色谱纯）、微孔滤膜（0.45μm）、九胜肽 -1 粗品、超纯水。

制备高效液相色谱仪、分析高效液相色谱仪、 C18 分析色谱柱（4.6mm×250mm）、反相聚合物柱（自填体积为 300mL填料 F 型粒径为 30 ～ 50μm 的 SBC MCI GEI 反相色谱填料）、纯水机、超声波清洗器 (KQ-500B）、旋转蒸发器（RE-52AA）、冷冻干燥机（FD-1C-50)、循环水式多用真空泵（SHB- Ⅲ )、双级旋片式真空泵（2XZ-4）。

实验过程

（1）样品溶解。将九胜肽 -1 粗品溶解于水溶液中，超声分散，用滤膜过滤，收集滤液；

（2）粗品分析及程序优化。取 1.2.1 所得滤液 0.1mL 用水溶液稀释至 1mL，用 C18 分析柱进行分析。

分析及程序优化条件： 流动相：A 相为体积比 0.1% 三氟乙酸 /水；B 相为体积比 0.1% 三氟乙酸 / 乙腈； 检测波长：215nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；洗脱时间：30min；洗脱梯度：B 相浓度从 10%-90%；根据粗品分析所得结果进行程序优化：洗脱梯度从 B 相浓度 10%-90% 逐步优化至 25%-55%。

（3）纯化。以优化程序为参考用反相聚合物制备柱对过滤后的九胜肽 -1 粗肽溶液进行纯化。

纯化条件：流动相：A 相为体积比 0.1% 三氟乙酸 / 水 B 相为体积比 0.1% 三氟乙酸 / 甲醇；检测波长：215nm；流速：20.0mL/min；进样量：10mL；洗脱时间：50min；洗脱梯度：B 相浓度 45%-60% ；收集目标物馏分并进行分析，分析条件同粗品分析，洗脱梯度：B 相浓度 25%-55%，将纯度﹥ 99% 的馏分合并，减压蒸馏浓缩，待用。

（4）除三氟乙酸。将纯化后的浓缩液使用 DEAE 弱阴离子交换柱脱除三氟乙酸。

除三氟乙酸条件：流动相：A相为2%醋酸；检测波长：215nm；流速：8.0mL/min；洗脱时间：50min；洗脱梯度：100%A 相等度洗脱；收集目标物馏分，减压蒸馏浓缩，待用。

（5）成骨五胜肽纯品分析及质谱确认。将 1mg 九肽 -1 纯品冻干粉溶解于 1mL 水溶液中。分析条件同粗品分析，洗脱梯度：B 相浓度25%-55%。 取 1mg 九肽 -1 纯品送第四军医大学进行质谱测定。

结果与讨论

粗品分析及程序优化

九肽 -1 粗品分析及程序优化图如图 1 所示 , 其中图 1 为根据粗品保留时间、纯度及峰型，进行三次程序优化后得到的分析图：分析序优化到洗脱梯度 B 相浓度 25%-55% 时，粗品中所含杂质峰与目标物明显分离开来，该程序可以为纯化提供参考。

图 1 九肽 -1 粗品分析及程序优化图

纯化

九肽 -1 纯化后的分析，B 相浓度 45%-60% 进行纯化时，杂质峰完全分离，且纯化后目标物纯度＞ 99.0%。实验证明该纯化条件用于九肽 -1 粗品纯化具有很好的适用性。

冻干粉纯度分析

冻干后称得九肽 -1 纯品，纯化收率为 79%。其中九肽 -1纯品冻干后的色谱表征，纯度为 99%。

结论

本方法打破了直接运用反相高效液相色谱法进行反复纯化的传统多肽纯化方法，将反相聚合物柱与弱阴离子交换柱结合使用，先对九肽 -1 进行粗纯，除去了大部分杂质，再用弱阴离子交换柱进行脱盐，将三氟乙酸型九肽 -1 转换成醋酸型九肽 -1，并进一步纯化了多肽，极大地提高了纯化效率，节省了整个纯化过程中流动相的成本，且纯化工艺较为环保。本方法粗纯过程中使用三氟乙酸 - 水溶液和三氟乙酸 -甲醇溶液做流动相，甲醇用量少且价格低廉，对环境污染小，两种柱子交替使用，有效地弥补了单一柱子难以完全分离粗肽中不同结构、不同化学性质的杂质，得到的九肽 -1 纯度高（大于 99%），且收率高。为安全温和的美白类化妆品的开发提供试验依据，同时为全面有效评价化妆品的功效提供参考。

参考文献

[1]杨勇．美白剂复配对改善皮肤色素沉积的探索．福建轻纺，2020(7)：43-46．