蛋白质二硫键异构酶抗体的应用

背景^[1-3]

蛋白质二硫键异构酶抗体是一类可以特异性结合蛋白质二硫键异构酶的多克隆抗体，主要用于体外检测蛋白质二硫键异构酶的WB、Elisa、IP、IF、IHC等免疫学实验。

蛋白质二硫键异构酶，又称脯氨酸4-羟化酶β亚基(P4HB)、细胞甲状腺激素结合蛋白(p55)和谷胱甘肽-胰岛素转氢酶，是一种外周膜蛋白，属于蛋白二硫键异构酶家族。

蛋白质二硫键异构酶抗体免疫组化

分泌蛋白需要通过在分子内或分子间形成二硫键，从而形成其天然构象。蛋白二硫键异构酶，可以催化这些二硫键的形成和异构化。PDI一方面可以通过二硫键异构酶活性促进蛋白内或蛋白间形成正确的二硫键，另一方面也可以催化某些蛋白的二硫键的水解。在肽链分部快速折叠成蛋白质过程中，抑制半胱氨酸之间形成错误位置的二硫键的酶。

蛋白质二硫键异构酶（Protein Disulfide Isomerase，PDI）是巯基异构酶家族的原型成员，具有促进蛋白质二硫键的形成及异构化、氧化还原和分子伴侣等多种作用。PDI最初发现于内质网中，近些年研究发现PDI也广泛存在于细胞表面和细胞外基质中，并且这些特殊位置的PDI在多种病理生理过程发挥重要调控作用。在本篇综述中，方超教授团队系统阐释了PDI的分子结构、PDI在细胞表面和细胞外的分布及外化机制；细致探讨了影响细胞表面和细胞外PDI活性的因素；系统介绍了细胞表面和细胞外PDI通过多种分子机制参与血栓形成、肿瘤、免疫炎症、血管重构、红细胞生理和镰状红细胞贫血等多种病理生理过程。

应用^[4][5]

用于蛋白质二硫键异构酶对毕赤酵母分泌淀粉样蛋白的影响研究

研究表明PDI基因是酿酒酵母的必需基因,敲除PDI会使酿酒酵母致死,而毕赤酵母和酿酒酵母基因组具有非常高的相似性,由此采用与PDI结构非常相似的MPDI基因代替PDI基因进行敲除从而避免酵母的致死情况。

研究通过同源重组的方法构建敲除载体,运用电转方法将其导入毕赤酵母中使之自发地发生同源重组,使目的基因失活。随后,将用于表达外源蛋白的重组质粒载体p PICZαA-α-syn和p PICZαA-c C通过电穿孔法分别转至正常毕赤酵母GS115菌株、敲除MPDI的毕赤酵母菌株GS115-ΔMPDI菌株中,从而得到四种重组菌株。通过免疫印迹反应检测这两种淀粉样蛋白在两种毕赤酵母菌株中的表达差异。另一方面,对PDI过表达的毕赤酵母菌株中野生型鸡胱抑素C（WT）及其淀粉样突变体I66Q、不稳定型截短突变体ΔW的表达量进行RNA测序分析,找出参与蛋白表达、蛋白降解的关键基因。

结果表明,敲除MPDI的毕赤酵母菌株在表达外源淀粉样蛋白α-syn时,其胞内表达量低于野生型毕赤酵母表达α-syn,胞外没有检测到α-syn的表达。c C的表达量获得了同样的结果。通过三种淀粉样蛋白在PDI正常表达与过表达菌株中的两两对比,分别筛选到了146、468、368个差异表达基因,其中分别有157、315、303个差异基因注释到KEGG生物通路。在细胞中,如果蛋白质出现了错误折叠的现象,导致其结构发生了变化,不能形成其天然构象时就会启动应激反应系统的蛋白质降解途径来帮助这些蛋白质降解。

其中,泛素-蛋白酶体降解途径发挥着重要作用。因此在筛选差异基因时,我们着重关注了参与泛素化途径的基因。在WT VS PDI-WT组中,没有找到参与泛素化降解的基因,而在I66Q VS PDI-I66Q组中,发现gene3818参与了泛素化降解,在ΔW VS PDI-ΔW组中,发现gene3818,gene4516都参与了泛素化降解。综上,敲除MPDI能够降低外源淀粉样蛋白α-syn和c C的表达量的结果暗示着MPDI协同PDI发挥分子伴侣的功能。在对关键基因的筛选中,认为虽然I66Q是淀粉样蛋白突变体,但是只发生了一个氨基酸的变化,与野生型鸡胱抑素C相比较,它的构象变化相对较小,所以只调动gene3818进行了蛋白质的降解。而对于ΔW,由于该截短型突变蛋白缺失了一个α-helix2结构,结构变化相对较大,所以调动了gene3818、gene4516两个基因对错误折叠蛋白进行降解。

实验筛选出的蛋白质降解基因可为后期深入了解其对淀粉样蛋白及错误折叠蛋白的降解提供线索,从而为淀粉样蛋白疾病的治疗提供潜在的分子伴侣药物新靶点。

参考文献

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[3]RNA-seq in Skeletal Biology.[J].Ayturk Ugur.Current osteoporosis reports.2019(4)

[4]Is the absence of alpha-helix 2 in the appendant structure region the major contributor to structural instability of human cystatin C?[J].Zhou Xuejie,Lu Xian,Qin Shuzhen,Xu Linan,Chong Xiaoying,Liu Junqing,Yan Pingyu,Sun Rui,Hurley Ian P,Jones Gary W,Wang Qiuyu,He Jianwei.Journal of biomolecular structure＆dynamics.2019(17)

[5]牛婷婷.蛋白质二硫键异构酶对毕赤酵母分泌淀粉样蛋白的影响[D].辽宁大学,2021.