人甘氨酸脱氢酶(GLDC)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人甘氨酸脱氢酶(GLDC)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人甘氨酸脱氢酶(GLDC)的含量。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象；放置室温，轻摇均匀，待结晶完全溶解后再配置洗涤液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成400ml工作浓度的洗涤液，未用完的放回4℃

3.20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

人甘氨酸脱氢酶(GLDC)ELISA试剂盒

实验原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人甘氨酸脱氢酶(GLDC)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人甘氨酸脱氢酶(GLDC)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

样本处理及要求：

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2．设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

3．样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5．弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

用于甘氨酸脱氢酶介导甘氨酸在胞内的神经保护作用研究

检测缺血性脑损伤后神经元胞内甘氨酸水平是否降低,探讨给予神经元内甘氨酸补充治疗的必要性和可行性,同时探索甘氨酸在胞内发挥神经保护作用的机制。为甘氨酸治疗中风提供依据。

方法:通过高效液相色谱法（HPLC）检测正常以及缺血损伤脑组织中甘氨酸水平。HPLC检测中风体外模型----氧糖剥夺模型中的神经元胞内甘氨酸水平。采用TTC染色法检测补充甘氨酸对缺血损伤体积的影响,MTT和LDH方法检测大鼠原代皮层神经元的活性和死亡。Westernblot检测相关的蛋白质表达。细胞免疫荧光和组织切片免疫荧光染色检测相关蛋白质在原代神经元和大脑中的分布情况。从而探索甘氨酸发挥神经保护作用的机制。

结果:1、缺血损伤模型中,缺血以及再灌注时,大脑组织甘氨酸含量升高,神经元内甘氨酸水平降低;体外中风模型中,损伤神经元内的甘氨酸减少;2、氧糖剥夺损伤后给予甘氨酸,神经元的活性增高,死亡率降低;3、大鼠大脑缺血再灌注后给予甘氨酸,大脑缺血面积减少,尼氏体增多;4、氧糖剥夺损伤后的早期,甘氨酸脱氢酶（GLDC）在神经元中表达降低,在大脑缺血再灌注早期,GLDC表达降低;5、甘氨酸对损伤后神经元活性的提高依赖于GLDC;6、抑制p53促进GLDC表达,增强甘氨酸的神经保护作用;7、GLDC表达增高时,外源甘氨酸对神经元促存活作用明显增强。当干GLDC表达时,甘氨酸神经保护作用显著降低。

结论:1、缺血损伤后,大脑甘氨酸含量增高,但神经元内甘氨酸降低。即缺血损伤后神经元内缺乏甘氨酸。2、补充甘氨酸降低缺血性脑损伤以及神经元OGD损伤3、甘氨酸对神经元的保护作用依赖于GLDC表达。4、通过抑制p53后,可以提高GLDC表达,从而增强甘氨酸的神经保护作用。

参考文献

[1]Identification and characterization of heptapeptide modulators of the glycine receptor[J].Garrett L.Cornelison,Natasha C.Pflanz,Megan E.Tipps,S.John Mihic.European Journal of Pharmacology.2016

[2]Stroke in 2015:the year of endovascular treatment[J].Keith W Muir.The Lancet Neurology.2016(1)

[3]Novel Stroke Therapeutics:Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments[J].Paul M.George,Gary K.Steinberg.Neuron.2015(2)

[4]Glycine bidirectionally regulates ischemic tolerance via different mechanisms including NR2A‐dependent CREB phosphorylation[J].Zheng Chen,Bin Hu,Fuzhou Wang,Linlin Du,Baosheng Huang,Lixin Li,Jia Qi,Xiang Wang.J.Neurochem..2015(3)

[5]廖华宝.甘氨酸脱氢酶介导甘氨酸在胞内的神经保护作用[D].武汉大学,2017.