人丙酮酸激酶M2型同工酶(M2-PK)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人丙酮酸激酶M2型同工酶(M2-PK)ELISA试剂盒是用ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中M2-PK含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中M2-PK水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入M2-PK抗原、生物素化的抗人M2-PK抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的M2-PK呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人丙酮酸激酶M2型同工酶(M2-PK)ELISA试剂盒

标本的采集及保存

1．细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。

2．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

3．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

各试剂在使用前平衡至室温。实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，应在试管中将样品用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100ul（取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100ul，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内）（此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显）。

7.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

应用^[4][5]

用于TKTL1、TUM2-PK、PFKFB3在肝癌中的表达及临床意义研究

研究转酮醇酶基因家族（TKT、TKTL1、TKTL2）在肝癌中的表达及其与肿瘤临床病理特征的关系,并探讨肝癌中转酮醇酶代谢途径可能的调控及影响因素。

方法：检测42例肝细胞肝癌组织及相应癌旁组织中转酮醇酶的活性;用RT-PCR的方法检测转酮醇酶基因家族各成员（TKT、TKTL1、TKTL2）及其代谢反应上游关键酶肿瘤M2型丙酮酸激酶（TUM2-PK）和6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2同工酶3（PFKFB3）mRNA在肝癌及癌旁组织中的表达,收集病例资料及随访资料,分析基因表达与临床病理参数间的关系,并采用Kaplan-Meier检验进行单因素生存分析,采用Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析。

结果肝癌组织与癌旁组织的转酮醇酶活性分别为20.16±1.67和2.62±0.88,肝癌组织中的转酮醇酶活性显著高于癌旁组织（P＜0.01）。TKT、TKTL1、TKTL2 mRNA在肝癌组织中的阳性表达率分别是78.57%（33/42）、90.48%（38/42）、66.67%（28/42）,在癌旁组织中的阳性表达率分别是92.86%（39/42）、40.48%（17/42）、47.62%（20/42）,肝癌组织中TKTL1 mRNA的阳性表达率显著高于癌旁组织（P＜0.01）,TKT和TKTL2 mRNA的阳性表达率在肝癌和癌旁组织间无显著性（P＞0.05）,肝癌组织中TKTL1 mRNA的阳性表达率显著高于TKT和TKTL2（P＜0.05）;TKT、TKTL1、TKTL2 mRNA在肝癌组织中的表达量分别是0.53±0.42、0.73±0.47、0.72±0.53,在癌旁组织中的表达量分别是0.39±0.33、0.33±0.28、0.40±0.28,TKTL1和TKTL2 mRNA在肝癌中的表达量均显著高于癌旁组织（P＜0.05）,而TKT mRNA在肝癌和癌旁组织间无显著差异（P＞0.05）。

TKTL1 mRNA的表达同肿瘤分化程度,静脉癌栓,肝内有无卫星灶以及5年生存率有关（P＜0.05）,而与性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、AFP水平无关（P＞0.05）;TKTL2 mRNA的表达仅与分化程度有关（P＜0.05）,与其它临床病理特征间无相关性（P＞0.05）。TUM2-PK与PFKFB3 mRNA在肝癌组织中的阳性表达率分别为83.33%（35/42）和73.81%（31/42）,在癌旁组织中的阳性表达率分别为57.14%（24/42）和52.38%（22/42）,TUM2-PK与PFKFB3 mRNA在肝癌组织中的表达量分别为0.7230±0.6744和1.0751±0.1712,在癌旁组织中的表达量分别为0.2594±0.2835和0.8769±0.4511,肝癌组织中TUM2-PK与PFKFB3 mRNA的阳性表达率及表达量均显著高于癌旁组织（P＜0.05）;TUM2-PK mRNA的表达与分化程度有关（P＜0.05）,PFKFB3 mRNA的表达与肿瘤分化程度、肝内转移以及5年生存率有关（P＜0.05）。

TUM2-PK mRNA的表达强度同TKTL1 mRNA的表达强度呈正相关（R=0.307,P＜0.05）;PFKFB3 mRNA的表达强度同TKTL1 mRNA的表达强度亦呈正相关（R=0.329,P＜0.05）;而TUM2-PK与PFKFB3 mRNA的表达强度同TKTL2的表达无相关性（P＞0.05）。将性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、静脉癌栓等临床病理参数及检测基因TKTL1、TKTL2、TUM2-PK、PFKFB3纳入COX比例风险回归模型,结果显示TKTL1是影响肝癌患者预后的独立危险因素（RR=3.604,P＜0.05）。

参考文献

[1]A novel assay system for the measurement of transketolase activity using xylulokinase from Saccharomyces cerevisiae[J].Jin-Young Lee,Dae-Eun Cheong,Geun-Joong Kim.Biotechnology Letters.2008(5)

[2]Overexpression of transketolase TKTL1 is associated with shorter survival in laryngeal squamous cell carcinomas[J].European Archives of Oto-Rhino-Laryngology.2007(12)

[3]A Mitochondria-K+Channel Axis Is Suppressed in Cancer and Its Normalization Promotes Apoptosis and Inhibits Cancer Growth[J].Sébastien Bonnet,Stephen L.Archer,Joan Allalunis-Turner,Alois Haromy,Christian Beaulieu,Richard Thompson,Christopher T.Lee,Gary D.Lopaschuk,Lakshmi Puttagunta,Sandra Bonnet,Gwyneth Harry,Kyoko Hashimoto,Christopher J.Porter,Miguel A.Andrade,Bernard Thebaud,Evangelos D.Michelakis.Cancer Cell.2007(1)

[4]Gene silencing of TKTL1 by RNAi inhibits cell proliferation in human hepatoma cells[J].Song Zhang,Ju-Hong Yang,Chang-Kai Guo,Peng-cheng Cai.Cancer Letters.2007(1)

[5]吴二斌.TKTL1、TUM2-PK、PFKFB3在肝癌中的表达及临床意义[D].苏州大学,2010.