NLN培养基的应用

背景^[1-3]

NLN培养基用于培养十字花科芸苔属植物（Brassica species）的细胞、组织和器官。硝酸钾作为氮源。L-谷氨酰胺、L-丝氨酸和谷胱甘肽作为氨基酸来源。

NLN培养基最初由Nitsch研制，用于甘蓝型油菜花药的液体培养和由分离的花粉诱导产生单倍体植物。NLN培养基中含有500 mg/l Ca(NO3)2.4H2O，为了避免有不溶性沉淀产生，Ca(NO3)2.4H2O必须在培养基完全溶解后再另行加入。

NLN培养基

配制方法：

用600ml蒸馏水溶解1.45g脱水培养基，用少量蒸馏水冲洗残余培养基粉末。

轻轻搅动使培养基完全溶解，加入所有热稳定添加剂。

用1N HCl/NaOH调节pH，定容至1000ml。121ºC灭菌15 min。

冷却至45ºC后，加入过滤除菌的热敏型添加剂。分装到无菌容器中。

目前采用最多的仍是MS、Miller、Nitsch培养基。针对不同的作物已经研制出了不少专用的花药培养基，如适合于禾谷类作物的N6培养基，这种培养基对不少园艺植物的花药培养效果也较好，蔬菜中芸薹属作物用NLN培养基，添加丝氨酸、谷胱甘肽、谷氨酸，效果也较好。曼陀罗、十字花科作物的花药在不添加生长调节剂的培养基上也可以产生大量的花粉胚和植株，但是对于大多数植物来说，培养基中的激素种类、配比和使用量，对诱发小孢子启动分裂、生长和分化常起着决定作用。

应用^[4][5]

用于青花菜和花椰菜DH系的创制研究

以20个不同基因型的青花菜和6个不同基因型的花椰菜为材料,对其进行小孢子培养获得胚状体,然后对子叶形胚状体进行继代、成苗、生根培养,移栽成活后进行倍性鉴定,将青花菜材料鉴定出的双单倍体（doubled haploid,DH）植株进行自交繁殖、园艺学性状调查以及优异DH系的筛选,为青花菜育种工作提供材料,花椰菜材料经小孢子培养获得再生植株,经过倍性鉴定,获得双单倍体植株。

结果如下:1.基因型在青花菜小孢子培养中是影响胚状体发生的主导因素之一。在20个试材中有10个试材成功获得了胚状体,其中‘B4’胚诱导率最高,为10.5胚/蕾;‘B8’胚诱导率最低,仅有0.33胚/蕾,前者比后者多10.17胚/蕾。在胚状体再生发育方面,10个基因型青花菜存在显著差异,‘B8’在10个基因型中成苗率居首位,为94.27%,‘B7’成苗率最低为57.24%,二者相差37.03%。不同基因型青花菜的胚发育畸形率有差异,最高的是‘B2’,为16.89%,比胚发育畸形率最低的‘B8’高出14.52%。青花菜再生植株的移栽成活率均达到80%以上,其中‘B6’移栽成活率为96.30%,在10个基因型中最高。

通过游离小孢子培养获得了620株再生植株,共有335株双单倍体植株,平均双单倍体率为54.03%,其中最高为73.44%（B1）。对获得的DH系进行园艺学性状调查,‘Y5’和‘Y8’颜色蓝绿、花球紧实、花蕾大小一致、茎不中空,是综合性状的DH系。2.在6个不同基因型花椰菜的游离小孢子培养中,有4个基因型成功获得胚状体,4个基因型花椰菜产胚量差异显著,其中‘WB03’产胚量为9.67胚/蕾,‘WB01’仅获得球形胚状体,产胚量仅为0.16胚/蕾,前者单蕾产胚量是后者的60.43倍。

试验表明,NLN培养基中加入活性炭的处理比未加入活性炭的处理对花椰菜胚胎发生的作用显著不同,后者未获得胚状体。此外,3个基因型花椰菜在成苗上存在差异,其中‘WB03’的成苗率最高,高达94.44%,‘WB04’成苗率最低,为73.20%,并且它的死亡率最高,为10.55%。

参考文献

[1]Optimizing protocol for efficient microspore embryogenesis and doubled haploid development in different maturity groups of cauliflower（B.oleracea var.botrytis L.）in India[J].R.Bhatia,S.S.Dey,Shritika Sood,Kanika Sharma,V.K.Sharma,Chander Parkash,Raj Kumar.Euphytica.2016(3)

[2]Efficient doubled haploid production in microspore culture of loose-curd cauliflower（Brassica oleracea var.botrytis）[J].Honghui Gu,Zhengqing Zhao,Xiaoguang Sheng,Huifang Yu,Jiansheng Wang.Euphytica.2014(3)

[3]Haploids and doubled haploids in Brassica spp.for genetic and genomic research[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture（PCTOC）.2011(3)

[4]Gametic embryogenesis and haploid technology as valuable support to plant breeding.[J].GermanàMaria Antonietta.Plant cell reports.2011(5)

[5]王影.青花菜和花椰菜DH系的创制[D].沈阳农业大学,2020.