细胞凋亡相关蛋白3抗体的应用

背景^[1-3]

细胞凋亡相关蛋白3抗体用人工合成的人Caspase-3本身的切割位点处一段多肽，经适当修饰后免疫兔子，然后用protein A和抗原多肽亲和柱经过两步纯化得到的高纯度多克隆抗体。Caspase-3抗体可以识别全长的Caspase-3(35kD)，也可以识别Caspase-3被剪切后产生的17kD片段。未发现和其它Caspase家族蛋白有交叉反应。Caspase-3是细胞凋亡过程中最关键的执行分子(key executioner)之一，可以剪切细胞凋亡过程中的许多关键蛋白，例如PARP。

Caspase-3的激活需要从没有活性的全长Caspase-3(35kD)，在Asp28和Ser29之间及Asp175和Ser176之间进行剪切，产生有活性的17kD肽段。Caspase-3的激活常被作为细胞凋亡的一个重要指标。细胞凋亡(apoptosis)是细胞为维持内环境稳定，更好地适应生存环境而主动形成的一种自我死亡过程，它涉及一系列基因的激活、表达及调控等作用。

细胞凋亡相关蛋白3抗体免疫组化

半胱天冬酶家族(Caspase)能够启动和维持细胞凋亡，而其成员Caspase-3是该细胞凋亡通路下游最重要的凋亡蛋白酶，其表达量直接反映细胞凋亡程度。Caspase-3是位于哺乳动物细胞凋亡通路下游关键的死亡蛋白酶。正常情况下，胞质中的Caspase-3以无活性的酶原形存在，细胞凋亡信号的出现可导致Caspase-3裂解、活化，活化的Caspase-3又进一步导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞走向死亡。因此Caspase-3表达量可以直接反映细胞凋亡程度。细胞凋亡程度Caspase-3是细胞凋亡过程中最关键的执行分子(key executioner)之一，可以剪切细胞凋亡过程中的许多关键蛋白，例如PARP。

Caspase-3的激活需要从没有活性的全长Caspase-3(35kD)，在Asp28和Ser29之间及Asp175和Ser176之间进行剪切，产生有活性的17kD肽段。Caspase-3抗体可以识别全长的Caspase-3(35kD)，也可以识别Caspase-3被剪切后产生的17kD片断。未发现和其它Caspase家族蛋白有交叉反应。

应用^[4][5]

用于FGF2通过调节Caspase-3、bcl-2表达在改善软骨终板退行性变的代谢调控及相关机制研究

外源性FGF2对正常软骨终板细胞的代谢调控影响选用正常人软骨细胞进行复苏、培养和传代,选择对数生长期细胞加入不同浓度（5ng/mL和10ng/mL）外源性FGF2进行培养。同时设置空白对照组,未加FGF2蛋白处理。采用RT-qPCR分析细胞中FGF2、FGFR1、FGFR3以及MMP-13、TIMP-4和Ⅱ型胶原的mRNA水平。应用免疫荧光法分析各组细胞Ⅱ型胶原蛋白表达。在培养后0、12、24、48、72h,应用CCK-8法检测不同时间点软骨细胞增殖活力水平。

应用Annexin V-FITC/PI双染法对软骨细胞培养后0、12、24、48、72h进行染色,采用流式细胞术对细胞凋亡水平进行分析。第三部分体外诱导软骨终板细胞退行性变性中的代谢调控及Caspase-3、bcl-2表达的机制研究选用正常人软骨细胞进行复苏、培养和传代,选择对数生长期细胞应用IL-1β诱导退行性变性。采用RT-qPCR分析细胞中FGF2、FGFR1、FGFR以及MMP-13、TIMP-4和Ⅱ型胶原的mRNA水平。应用免疫荧光法分析各组细胞Ⅱ型胶原表达。

在培养后0、12、24、48、72h,应用CCK-8法检测不同时间点软骨细胞增殖活力水平。采用蛋白印迹定量分析检测细胞中Caspase-3、bcl-2蛋白表达水平。应用Annexin V-FITC/PI双染法对软骨细胞培养后0、12、24、48、72h进行染色,采用流式细胞术对细胞凋亡水平进行分析。

外源性FGF2联合FGFR1阻断剂对于延迟软骨终板细胞变性的影响选用正常人软骨细胞进行复苏、培养和传代,选择对数生长期细胞应用IL-1β诱导退行性变性。

取外源性人重组FGF2蛋白对软骨细胞进行处理并分为两组:FGF2组和FGF2+PD（FGFR1抑制剂）组;另选取一空白组作为对照,其中未加FGF2、PD蛋白进行处理。采用RT-qPCR分析细胞中FGF2、FGFR1、FGFR3以及MMP-13、TIMP-4和Ⅱ型胶原的mRNA水平。应用免疫荧光法分析各组细胞Ⅱ型胶原表达。在培养后0、12、24、48、72h,应用CCK-8法检测不同时间点软骨细胞增殖活力水平。应用Annexin V-FITC/PI双染法对培养后0、12、24、48、72h进行染色,采用流式细胞术对细胞凋亡水平进行分析。

研究结果1、严重退变的相邻椎体间的位置高度较轻度退变降低,且MRI图像中水分程度亦较轻度病变减低。HE染色发现软骨终板组织比髓核组织质地更硬、分布更密集,软骨终板细胞的分布位置比髓核细胞更近。椎间盘重度退变的软骨终板细胞中FGF2、FGFR1、MMP-3表达水平较椎间盘轻度退变表达显著增加（P<0.001）;但在两种不同程度退行性改变中,FGFR3的表达量无统计学意义（P>0.05）;重度椎间盘退变中Ⅱ型胶原和TIMP-4表达水平较轻度椎间盘退变降低（P<0.05）。

2、外源性FGF2蛋白处理72h后,三组细胞中FGF2 mRNA表达无统计学意义（P>0.05）;FGF2处理组FGFR1和FGFR3水平均明显高于对照组（P<0.05）。对FGFR1表达水平进行分析,5ng/mL组与10ng/mL组间结果无统计学意义（P>0.05）;对FGFR3表达水平进行分析,1Ong/mL组表达水平明显高于5ng/mL组（P<0.001）。外源性FGF2蛋白处理72h后,两组细胞TIMP-4表达水平较对照组明显上升,且10ng/mL组表达水平高于5ng/mL组（P<0.05）;三组细胞MMP-13表达水平无统计学意义（P>0.05）。对Ⅱ型胶原荧光定量进行分析,10ng/mL组细胞表达水平显著高于对照组和5ng/mL组（P<0.001）;对照组和5ng/mL组间水平无统计学意义（P>0.05）。

三组细胞72h不同时间点细胞增殖活力均随时间呈增加趋势（P<0.05）。三组间相同时间点增殖活力比较，三组细胞凋亡率水平不全相同（P<0.05）,且培养后Oh,三组细胞凋亡率水平无统计学意义（P>0.05）;培养后12h,10ng/mL组凋亡率高于5ng/mL组和对照组,且5ng/mL组凋亡率低于对照组（P<0.05）;培养后24h、48h、72h,三组细胞凋亡率水平比较均无统计学意义（P>0.05）。

参考文献

[1]Role of lncRNA PART1 in intervertebral disc degeneration and associated underlying mechanism.[J].Zhang Zongyu,Huo Yongfeng,Zhou Zhijing,Zhang Peng,Hu Jun.Experimental and therapeutic medicine.2021(2)

[2]Evaluation of a rabbit model of adjacent intervertebral disc degeneration after fixation and fusion and maintenance in an upright feeding cage.[J].Hei Long,Ge Zhaohui,Yuan Wenqi,Suo Ling,Suo Zhigang,Lin Leilei,Ding Huiqiang,Qiu Yusheng.Neurological research.2021

[3]Elevated lymphotoxin-α（TNFβ）is associated with intervertebral disc degeneration[J].Guo Zhu,Qiu Chensheng,Mecca Christina,Zhang Yang,Bian Jiang,Wang Yan,Wu Xiaolin,Wang Tianrui,Su Weiliang,Li Xianglin,Zhang Wei,Chen Bohua,Xiang Hongfei.BMC Musculoskeletal Disorders.2021(1)

[4]Danshen Attenuates Intervertebral Disc Degeneration via Antioxidation in SD Rats[J].Qin Rongqing,Dai Shouqian,Zhang Xing,Liu Hongpeng,Zhou Bing,Zhou Pin,Hu Chuanliang,Yang Sidong.Oxidative Medicine and Cellular Longevity.2020

[5]宋华.FGF2通过调节Caspase-3、bcl-2表达在改善软骨终板退行性变的代谢调控及相关机制研究[D].山东大学,2021.