BHK-21细胞的应用

背景^[1-3]

BHK-21细胞是由IA-Macpherson和M-G.P-Stoker于1961年3月从1日龄的仓鼠建立的。随后84天连续培养，仅中断8天进行冻存。通过单细胞分离建立了13号克隆，即BHK-21。BHK-21细胞可用作转染宿主，用于表达包含选择及扩增标记的DNA的载体。

BHK-21细胞

培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。

应用^[4][5]

用于BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒研究

新城疫（Newcastle disease,ND）因其高发病率和高死亡率给世界各地的家禽养殖业造成了巨大威胁,接种疫苗是防控ND最有效的措施。采用传统的鸡胚工艺生产新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）疫苗,存在SPF鸡胚供应不足、质量控制困难及规模放大受限等问题;基于细胞的贴壁培养工艺存在成本高、操作复杂和过程控制困难等缺点;而应用无血清悬浮培养工艺虽可克服上述缺陷,但存在缺乏对NDV敏感的悬浮细胞系、适于NDV扩增的无血清维持培养基及工艺不成熟等问题。针对上述问题,亟需开发基于动物细胞的NDV悬浮培养工艺及适于NDV增殖的无血清维持培养基。

以实验室自主研发的无血清培养基SF201为生长及维持培养基,通过敏感细胞株筛选、病毒适应及细胞毒种制备、病毒接种条件优化,建立了无血清悬浮培养生产NDV工艺。当BHK-v002细胞生长至约9.0×106cells/mL时,用新鲜培养基将活细胞密度稀释至6.0×106 cells/mL,在MOI为0.005、TPCK-胰酶浓度为5μg/mL条件下接种病毒,继续培养96 h后收获病毒,收获病毒液的血凝效价（HA效价）为8.5 log2HAU/25μL,单细胞产毒量（Svy）达到1685.9virions/cell。为进一步优化培养过程,提高病毒产量,应用Design Expert软件对6种无血清培养基进行混料设计,成功筛选出无血清维持培养基BMM11,培养后收获的病毒上清液中HA效价和Svy分别达到9.5 log2HAU/25μL和3185.1 virions/cell。以8 g/L浓度的F水解物添加至BMM11培养基（BMM11-F）,HA效价和Svy分别达到10.4 log2HAU/25μL和6981.5 virions/cell。

为指导成分明确的无血清维持培养基的研制,考察了维持培养基BMM11及关键组分葡萄糖和谷氨酰胺对细胞生长、代谢和病毒增殖的影响。在维持培养基BMM11中病毒增殖后期葡萄糖和Gln耗竭不利于病毒的增殖和细胞活性的维持;高浓度葡萄糖所致的酸性pH环境降低病毒滴度,故应控制葡萄糖补加量;当Gln添加量为4.088 g/L时,病毒HA效价和Svy分别为10.5 log2HAU/25μL和6704.4 virions/cell,与BMM11-F培养基相当。

参考文献

[1]Hemagglutinin–Neuraminidase and fusion genes are determinants of NDV thermostability[J].Tong Liu,Yang Song,Yanling Yang,Yawen Bu,Jinlong Cheng,Guozhong Zhang,Jia Xue.Veterinary Microbiology.2019

[2]Phosphoprotein Contributes to the Thermostability of Newcastle Disease Virus[J].Yang Zhao,Huairan Liu,Feng Cong,Wei Wu,Ran Zhao,Xiangang Kong,Luis Martinez-Sobrido.BioMed Research International.2018

[3]Infection-Induced Peroxisome Biogenesis Is a Metabolic Strategy for Herpesvirus Replication[J].Pierre M.Jean Beltran,Katelyn C.Cook,Yutaka Hashimoto,Cyril Galitzine,Laura A.Murray,Olga Vitek,Ileana M.Cristea.Cell Host&Microbe.2018(4)

[4]Diagnostic and Vaccination Approaches for Newcastle Disease Virus in Poultry:The Current and Emerging Perspectives[J].Muhammad Bashir Bello,Khatijah Yusoff,Aini Ideris,Mohd Hair-Bejo,Ben P.H.Peeters,Abdul Rahman Omar,Xiaofeng Fan.BioMed Research International.2018

[5]姬阿美.BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒[D].华东理工大学,2020.