大鼠硝基还原酶(NTR)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠硝基还原酶(NTR)ELISA试剂盒可以用于检测各种样本中人抗乙型肝炎病毒表面抗体(HBSAB)的含量。

原理：试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠硝基还原酶(NTR)捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠硝基还原酶(NTR)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

大鼠硝基还原酶(NTR)ELISA试剂盒

样品收集、处理及保存方法:

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

操作步骤:

1.从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

4.随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于大肠杆菌中硝基还原酶NfsA的表达纯化与催化性质研究

大肠杆菌硝基还原酶是一种以FMN为辅基且依赖于NAD（P）H的氧不敏感型黄素蛋白,能够催化多种硝基底物的还原,在生物转化、生物修复和前药激活等方面应用广泛。目前已获得3种大肠杆菌硝基还原酶,分别为NfsA、NfsB和YdjA,其中NfsA与研究较为深入的NfsB底物谱和结构特点类似,但它们分属硝基还原酶Group A和Group B家族,氨基酸序列一致性很低,在辅酶偏好和底物区位选择性还原等方面表现出明显的差异。

为了解NfsA的催化性质,开展以下工作（1）利用NCBI中提供的NfsA的序列（GenBank:BAA07425.1）设计引物,从E.coli K12菌株中获取nfsA基因,将其克隆至pET28a,转化至E.coli BL21（DE3）中,经表达条件优化,获得高表达的重组酶,利用亲和层析获得纯化酶。

（2）比较NfsA和NfsB的晶体结构,发现Phe42在NfsA中存在,在NfsB中缺失。为了探索Phe42对NfsA的作用,通过PCR定点突变获得三个突变体F42Y、F42N和F42A。以呋喃西林为底物检测突变体的酶活力变化,发现活力较野生型分别下降51.7%、96.3%和98.7%。测定了NfsA与突变体对辅酶NADPH以及底物NFZ、CB1954、TNT和2,4-DNT的动力学数据,其中NfsA对于NFZ的亲和力,Km,值为12μM,其次是TNT,Km值为29μM。比较野生型和三个突变体的动力学数据,发现突变体的Km基本不变,而Kcal显著降低,并导致Kcat/Km显著降低。通过远紫外圆二色谱分析突变体与NfsA的二级结构,发现F42N和F42A在波长208nm到222nm之间,椭圆度显著改变,说明螺旋含量减少,酶的二级结构改变,而F42Y基本不变。上述研究表明,Phe42对于维持NfsA的酶活力和二级结构发挥很重要的作用。

（3）比较Group A家族和Group B家族的氨基酸序列,结合晶体结构和氨基酸性质分析,推测Arg15、Lys167和Arg203可能是NfsA中与NADPH结合的关键氨基酸。对其分别进行突变,获得突变体R15A、K167A、R203A和R203D。测定了突变体利用两种辅酶NADH和NADPH时催化活性和动力学常数。结果表明,四个突变体利用NADPH的催化活性显著降低,且K167A、R203A和R203D降低了酶对NADPH的亲和力,说明它们与NADPH的结合有关。K167A提高了酶利用NADH的催化活性,推测其可能影响辅酶偏好性。

参考文献

[1]Structure-based development of bacterial nitroreductase against nitrobenzodiazepine-induced hypnosis[J].Shiuan-Woei LinWu,Che-An Wu,Fu-Chuo Peng,Andrew H.-J.Wang.Biochemical Pharmacology.2012(12)

[2]Biological and structural characterization of the Mycobacterium smegmatis nitroreductase NfnB,and its role in benzothiazinone resistance[J].Molecular Microbiology.2010(5)

[3]Flavin-containing reductase:new perspective on the detoxification of nitrobenzodiazepine[J].Shiuan-Woei LinWu,Andrew H-J Wang,Fu-Chuo Peng.Expert Opinion on Drug Metabolism&Toxicology.2010(8)

[4]Crystal Structure of a Minimal Nitroreductase,ydjA,from Escherichia coli K12 with and without FMN Cofactor[J].Ji-Woo Choi,Jieun Lee,Kosuke Nishi,Yong-Sung Kim,Che-Hun Jung,Jeong-Sun Kim.Journal of Molecular Biology.2008(1)

[5]战君菲.大肠杆菌中硝基还原酶NfsA的表达纯化与催化性质研究[D].大连理工大学,2013.