香叶基焦磷酸铵盐的应用

背景及概述^[1][2]

香叶基焦磷酸 ( geranylpyrophosphate，GPP) 也称为香叶基二磷酸（GDP），具有 C10骨架，是萜类的直接前体之 一，其可以在单萜烯合酶 (TPS) 作用下生成单萜，也可以继续催化为法尼基焦磷酸( farnesyl pyrophosphate，FPP) 或香叶基香叶基焦磷酸 ( geranylgeranyl pyrophosphate，GGPPS)合成类胡萝卜素。

香叶基焦磷酸盐包括香叶基焦磷酸铵盐，是生物合成法呢基焦磷酸盐，香叶基焦磷酸铵盐是胆固醇，萜烯和萜类化合物的HMG-CoA还原酶途径中的中间体；异戊烯基焦磷酸盐（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸盐（DMAPP）通过香叶基焦磷酸合成酶（二甲基烯丙基转移酶）缩合以产生香叶基焦磷酸盐（GPP）和焦磷酸盐。

DMAPP和IPP的碳骨架已经着色以指示它们在GPP中的位置。人体内类胡萝卜素分解可形成维生素 A，植物体内类胡萝卜素的含量对抗逆性和生长发育有重要影响。香叶基焦磷酸铵盐CAS号763-10-0，化学式C10H20O7P2。分子量314.20900。密度1.129g/cm3，沸点484.2ºC at 760 mmHg，沸点484.2ºC  at 760 mmHg，闪点20ºC，折射率1.51。

应用^[1]

香叶基焦磷酸铵盐是胆固醇，萜烯和萜类化合物的HMG-CoA还原酶途径中的中间体，如可用于合成环脂肽类抗生素。环脂肽是由微生物发酵产生的一类双亲性化合物，其一端由多个氨基酸组成的肽环形成亲水基，另一端由脂肪烃链形成亲油基。它们具有独特的化学结构和生理功能。环脂肽类化合物主要由革兰氏阳性芽孢杆菌代谢产生，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗支原体、降低胆固醇等生物活性。

由于环脂肽化合物具有广谱抗菌活性，其抗菌机理不同于目前上市的任何一类抗生素，临床上表现出高效、低毒、不易产耐药性的特点，使其在医药领域具有良好的应用前景。但是，由于发酵液中同时存在多种环脂肽及其同系物，且每种环脂肽的含量较低，因此大量获得高纯度的产品难度很大。

目前，仅放线菌来源的环脂肽化合物达托霉素的开发较为成功，2003年9月首次在美国上市，用于万古霉素抗性的粪肠球菌及对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌的治疗。有研究提供了一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法。通过 Fomc固相合成法，人工合成具有10个氨基酸残基的直链前体肽Pre-ComX P10，将其与ComQ蛋 白作用后，得到ComP/ComA双组份信号转导系统的信号分子ComX P10。

将信号分子ComX P10 与解淀粉芽孢杆菌Q-426共同培养，人工增强该菌ComP/ComA信号转导通路的信号强度，从 而促进其环脂肽类抗生素的产量。包括如下步骤：

(一)采用Fmoc固相法合成Pre-ComX P10，所述Pre-ComX P10的氨基酸序列为 YKWDGGFSIV；具体过程为：以Fomc保护酪氨酸取代的2-氯三苯甲基氯树脂为起始原料，利用Fomc固相合成法，按顺序依次连接9个Fomc保护的氨基酸，以冷冻的三氟乙酸、1，2-乙二硫醇、间甲酚的混合液为裂解液，将Pre-ComX P10从2-CTC树脂上切割下来；所述的氨基酸分别为Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)- OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc- Val-OH；所述三氟乙酸、1，2-乙二硫醇、间甲酚的体积比为95：4：1。

(二)制备信号分子ComX P10；具体过程为将Pre-ComX P10与香叶基焦磷酸铵盐、ComQ 在缓冲体系中反应生成ComX P10，更具体为将Pre-ComX P10与香叶基焦磷酸铵盐、ComQ在缓冲体系中反应生成ComX P10；所述的缓冲体系为N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸/氢氧化钠(pH7.5，5μmol/L氯化镁，10μmol/ L氯化锌)；反应温度为35-37℃；反应时间为3-7小时。反应方程式如下：

所述ComQ的制备方法如下：利用化学转化法将重组质粒转入重组大肠杆菌BL21 (E.coli BL21(RIL))感受态细胞，并于含有氨苄霉素的LB固体培养基上过夜培养，当OD600 在0.6-1.2之间时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，30℃培养8h后收集菌体，将收集的菌体用缓冲液悬浮后进行超声破碎，以13000rpm转速离心50min，得到上清液，将上清液依次经金属离子螯合层析、离子交换层析和凝胶过滤层析后，得到ComQ蛋白。(三)解淀粉芽孢杆菌Q-426发酵，在发酵过程中添加信号分子ComX P10。

主要参考资料

[1] 马颖瑞, 龚一富, 周静, 刘浩, 朱帅旗, & 王何瑜. (2017). 绿色杜氏藻香叶基焦磷酸合成酶基因 (GPS) 生物信息学与诱导表达分析. 核农学报, 31(2), 248-254.

[2] CN201810320212.6一种提高解淀粉芽孢杆菌Q-426环脂肽类抗生素产量的方法