布雷菲尔德菌素A的应用及合成方法

背景及概述^[1][2]

近年的研究结果表明细胞粘附分子在诸如肿瘤、过敏和炎症疾病的过程中起着重要的作用，人们已开始从微生物代谢产物中筛选能抑制特定粘附分子介导的细胞间粘附过程的化合物单体，以求开发新的防止肿瘤浸润和转移或治疗风湿性关节炎的药物，在筛选真菌活性代谢产物的过程中，发现许多属于青霉Penici llium属(包括其有性世代属Eupenicillium和Talaromyces)的菌株的共同代谢产物布雷菲尔德菌素A具有抑制内皮白细胞粘附分子ELAM-1的活性。

布雷菲德菌素A （（+）-Brefeldin A，BFA）是一种真菌合成的大环内酯类抗生素，也称之为斜卧菌素或壳二孢素，布雷菲德菌素A诱导高尔基体的分解，反竞争性抑制蛋白质从内质中转运至高尔基体，具有抗真菌、抗病毒、抗有丝分裂、抗肿瘤，抗线虫等生物学活性。目前，作为一种重要的分子工具，布雷菲德菌素A被广泛应用于哺乳动物信号传导途径的研究。美国肿瘤研究院（NCI）发现，布雷菲德菌素A能够诱导肿瘤细胞分化和凋亡，作为化学治疗试剂用于肿瘤治疗具有广阔的应用前景。

结构^[2]

作用机制^[2]

高尔基体接受来自内质网新合成的蛋白质，对其实施翻译后修饰过程，最后将这些修饰过的蛋白质发送到胞内目的地。潴泡模型描述分泌性蛋白质是如何从早期的高尔基体潴泡单元转移到晚期潴泡，根据潴泡模型，分泌性蛋白质利用潴泡成熟或顺向小泡转运机制通过高尔基体，而需要回收到内质网的蛋白质通过逆向小泡被分拣、循环，小泡形成取决于COPI包裹Arf1-GTP组装。

布雷菲德菌素A，通过反竞争性抑制作用，稳定Arf：sec 7域复合物，与过渡Arf-GDPsec7域复合物结合、形成流产性Arf-GDP：BFA：sec 7域复合物。2003年Goldberg等得到了布雷菲德菌素A与Arf-Sec7d结合物的单晶结构，从而为证实鸟嘌呤核苷的交换的机理提供了有力证据。布雷菲德菌素A的这种小分子反竞争性的抑制蛋白质的作用对药物研究和基础生物学研究都具有重要的意义。

布雷菲德菌素A不仅显著影响哺乳动物的分泌途径，还会引起细胞的形态变化，特别是诱导高尔基体的分解，导致高尔基分解后酶重新分配回内质网。美国国家癌症研究院发现布雷菲德菌素A还具有选择性抑制和杀死人肿瘤细胞活性。布雷菲德菌素A通过不依赖于p53凋亡机制诱导人前列腺癌细胞凋亡，由于p53调节的凋亡途径往往在前列腺癌细胞中被终止，因此，诱导不依赖于p53的细胞凋亡的药物如布雷菲德菌素A是有效的备选化疗药物。联合使用低剂量BFA提高吉西他（Gemcitabine）与对人胰腺癌细胞MIA PaCa-2 细胞线的作用效果。

应用^[1-2]

布雷菲德菌素A是一种天然存在的大环内酯类抗生素，能有效抑制蛋白质由内质网向高尔基体的转运过程，是一种广泛应用于哺乳动物信号传导研究的分子工具；布雷菲德菌素A具有抗真菌、抗病毒、抗有丝分裂、抗肿瘤等生物学活性，布雷菲德菌素A及其衍生物是重要的抗肿瘤候选药。鉴于布雷菲德菌素A具有多重生物学活性及潜在的抗肿瘤药用价值，布雷菲德菌素A开发和研究工作一直受到产学界的高度重视，是当前抗癌药物开发研究的一个热点。

制备 ^[2]

1.化学合成

由于具有广泛的生物活性和独特的大环内酯结构，因而布雷菲德菌素A结构鉴定及其合成成为有机合成化学家最具吸引力的目标分子之一。1976年Corey和Wollenberg首次报道了布雷菲德菌素A的合成。1979年，Kitahara小组完成布雷菲德菌素A的首次全合成。自Corey的消旋体合成工作以来，有关布雷菲德菌素A的片段合成、表观合成和全合成的报道层出不穷。2001年Kim小组以分子内的1，3-偶极环加成和关环复分解反应构建内酯大环。

2.发酵合成

文献报道的、具有布雷菲德菌素A合成能力的菌种包括青霉属（Penicillium）、斜卧青霉（Penicillium decumbens）、蓝青霉（Penicillium cyaneum）、壳二孢属（Ascochyta）、拟青霉（Paecilomycessp. ）、棒曲霉（Aspergillus clavatus）、分支孢属（Cladosporium sp.）、链格孢菌属（Alternariazinniae）、茎点霉属（Phoma）、踝节菌属（Talaromyces sp.），布雷正青霉（Eupenicilliumbrefeldianum）ATCC 58665 已经被用于布雷菲德菌素A中试规模生产。

1995年，McCloud报道了11000 L规模上E. brefeldianum合成布雷菲德菌素A 的发酵过程，McCloud 对真菌E. brefeldianum（ATCC 58665）液体进行深层发酵，25℃通气搅拌培养，转速250 r /min，空气流量0.73 vvm，培养基组成：葡萄糖20 g/L，麦芽汁2 g/L，酵母膏2.5 g/L，蛋白胨2 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4·7H2O2g/L，CaCO3 4 g/L，pH 7.0，布雷菲德菌素A发酵单位为169 mg/L。

国内使用青霉菌液体发酵，液体发酵培养基： 马铃薯200 g/L （煮汁），葡萄糖20 g/L，（NH4）2SO4 4.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 2.0 g/L，CaCO3 5.0 g/L，pH自然，装液量100：250 （v/v），28°C，120 r/min，振荡培养7 d，最终产量151.6 mg/L；并且首先利用青霉进行固体发酵，布雷菲德菌素A的固体发酵培养基的条件为：马铃薯300 g/L（煮汁），葡萄糖25 g/L，（NH4）2SO4 0.2 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，琼脂2.0 g/L，pH自然，接种量5.0×105孢子/100 mL固体培养基，培养温度28°C，静置培养8 d，布雷菲德菌素A的产量达到392.16 mg/L。

主要参考资料

[1] 褚以文, 彭义杰. 细胞粘附分子 ELAM-1 的抑制剂——布雷菲德氏真青霉产生的布雷菲尔德菌素 A[J]. 中国抗生素杂志, 1999, 4.

[2] 薛锋, 王亚军, 郑裕国. 新型抗肿瘤抗生素布雷菲德菌素 A 的研究进展[J]. 科技通報, 2010, 26(4): 536-541.