孔雀石绿的毒性

背景及概述^[1][2]

孔雀石绿（MG），化学名称为四甲基代二氨基三苯甲烷，别名碱性孔雀石绿、碱性绿、盐基块绿、苯胺绿等，为翠绿色有光泽的结晶，属三苯甲烷类染料。孔雀绿是一种有机染料，易溶于水，水溶液呈蓝绿色，工业应用广泛。孔雀绿能对水体中的鱼、虾产生毒性，可通过食物链对哺乳动物以及人类产生致畸、致癌、致突变等作用，并对肿瘤生长起到促进作用，因而这种物质在陆地和水生生态系统中的生物积累对环境和人类健康都有影响。因此，对孔雀绿废水进行处理已成为当务之急。

目前研究的降解孔雀绿的方法主要包括微生物法、吸附法、微波法、光催化法和芬顿试剂法等等，其中以微生物法和光催化降解研究最多。生物降解主要是通过微生物的相关酶系对染料分子进行氧化或还原，破坏其发色基团或不饱和键，使染料分子最终降解为无机物或成为微生物自身需要的营养物，主要降解途径是：孔雀绿经过羟基化后，降解生成米氏酮和苯酚；此外，孔雀绿还可以通过逐步的脱甲基反应，降解生成二甲氨基二苯甲酮和对氨基苯酚，二甲氨基二苯甲酮可以通过加羟基或逐步的脱甲基反应进一步降解。

光催化法降解孔雀绿可能的途径是孔雀绿的中心碳原子和羟基自由基作用，中心碳原子的C-C键断裂生成4-羟基二乙氨基苯胺和4-二甲氨基苯甲酮，这些碎片分子进一步开环氧化为对羟基苯甲酸和苯甲酸等，这些带苯环的酸性物质再进一步氧化为草酸，丁烯二酸，甲酸等小分子的酸。这些方法在降解过程中容易产生有毒的酚类、苯胺和酮类物质，降解过程复杂，反应条件难于控制，与此同时，反应时间较长（如光催化降解孔雀绿为小分子化合物需要40小时），耗费较大的能量。

理化性质

孔雀石绿易溶于水和乙醇。它是由一分子苯甲醛和两分子 N，N-二甲基苯胺在盐酸或硫酸中缩合生成四甲基代二氨基三苯甲烷的隐性碱体后，在酸性介质中被二氧化铅氧化制得的深绿色晶体，因其外观色呈孔雀绿而得名。孔雀石绿多以草酸盐形式制备并在市面上出售，盐酸盐( malachite green chloride/C23H25 N 2 +Cl-)比较少见。孔雀石绿盐酸盐是 1种工业级化学物质，是在孔雀石绿生产过程中加氯化锌而合成的 1 种双锌盐。在水溶液中，孔雀石绿阳离子(有色形式) 和活性氢氧根离子结合，生成非离子化的无色醇碱，其具有较高的亲脂性，因而认为孔雀石绿入侵细胞可能是以醇碱的形式。

代谢^[2]

孔雀石绿进入动物机体后，通过生物转化，还原成脂溶性的无色孔雀石绿，并在组织中蓄积，因此在鱼体组织中检测到的残留物主要是无色孔雀石绿，其在机体内的分布和代谢速率主要取决于脂肪的含量。用高效液相色谱/大气压化学电离质谱分析方法( HPLC/APCI/M S)在肝组织提取液中检出无色孔雀石绿在甲状腺过氧化物酶( TPO) 氧化催化下脱甲基生成的初级和次级代谢产物芳香胺。

这些代谢产物与具有致癌作用的芳香胺的结构类似，可直接或酯化后与DNA 发生反应，通过对肝脏 DNA 进行32 P -后标记可证明 DNA 加合物的结构，这次验证了其潜在的结构致癌性。从图中可以看出孔雀石绿在机体内具有 2 种代谢途径：一是孔雀石绿在还原酶的催化下降解成无色孔雀石绿；二是在细胞色素 P-450 催化下经 N —脱甲基作用生成初级和次级代谢产物芳香胺。无色孔雀石绿的代谢途径如下：一是在氧化酶的作用下被重新氧化成孔雀石绿；二是在 TPO 催化下脱甲基生成初级和次级代谢产物芳香胺，芳香胺再进一步酯化后与DNA反应生成 DNA 加合物。

毒性^[2]

1. 孔雀石绿对水生动物的毒副作用

相关研究表明孔雀石绿的毒性较强，对水生动物的安全浓度较低。如对翘嘴红、虹鳟鱼苗、加州鲈鱼和对虾虾苗的安全浓度分别为 0.031，0.025，0.02 和
0.01 mg/ L，这比孔雀石绿的有效用药浓度 0.10 ～0.20 mg/L低，因此孔雀石绿在上述水产养殖动物中使用是不安全的。研究发现，随着暴露时间、温度和浓度的增加，孔雀石绿和无色孔雀石绿对鱼类的毒性增强，另外毒性也与环境因素，特别是 pH 值、硬度和溶解氧的多少有关。近来国外学者关于孔雀石绿和无色孔雀石绿对虹鳟、鲇鱼等鱼类各器官的毒性、药物代谢动力学、组织病理学进行了研究。

2. 孔雀石绿对哺乳动物的毒性

1）致癌性：孔雀石绿的官能团三苯甲烷分子中与苯环相连的亚甲基和次甲基受苯环影响有较高的反应活性，可生成三苯甲基，同时孔雀石绿能抑制人体谷
胱甘肽-S-转移酶的活性，嵌入 DNA 生成加合物。这 2种情况均能造成人体器官组织氧压的改变和脂质过氧化，使细胞凋亡，进而诱发肿瘤，而来源于上皮组织的恶性肿瘤即为“癌”。

孔雀石绿代谢产物的衍生物及初级和次级芳香胺在癌症发生中起着重要的作用。如小分子芳香胺，尤其是 1～4 个芳香环结构进入人体后，会穿过细胞膜，到达细胞核中的 DNA。芳香胺易产生活泼的亲电子“阳氮离子”，攻击 DNA 上的亲核位置，相互以共价键结合，或者芳香胺分子的扁平部分“插入”正常细胞中 DNA 螺旋线结构的相邻碱基对之间，从而破坏DNA 导致癌变。

2）遗传毒性：研究发现孔雀石绿和无色孔雀石绿的致基因突变试验结果均为阳性。孔雀石绿可诱发叙利亚仓鼠胚胎细胞的恶性转化，并诱导细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的机制与改变肿瘤抑制基因p53 和 bcl-2 家族蛋白基因的表达有关。

孔雀石绿草酸盐在 S9 作用下可致鼠伤寒沙门菌 T98 基因突变，尽管体内微核实验未发现致染色体损伤作用，但给予F344 大鼠和 B6C3F1 小鼠 9，100 mg/kg 和 600 mg/kg的孔雀石绿或 96 mg/kg 和 580 mg/kg 的无色孔雀石绿 28 d，用32P 后标记法在肝脏中检出 DNA 加合物，并且随着孔雀石绿和无色孔雀石绿浓度的增加，DNA 加合物的量也增加。外周血淋巴细胞微核试验和转基因小鼠肝脏中凝血抑制因子( lacI) 突变试验结果呈阴性。

3）慢性毒性：通过动物试验发现孔雀石绿可引起肝、肾、心脏、脾、皮肤、眼睛、肺等多器官毒性。在孔雀石绿和无色孔雀石绿的毒性和体内代谢试验中，给予 F344 雌性大鼠和 B6C3F1 小鼠 1 200mg/kg 的孔雀石绿或 1 160 mg/kg 无色孔雀石绿 28 d，测得 F344 雌性大鼠 r-谷胺酰转肽酶水平与对照组相比有明显的线性增长趋势，并诱发小鼠膀胱上皮细胞和甲状腺滤泡细胞大量凋亡，肝细胞空泡化。

同时，无色孔雀石绿可诱裂 Hamster 鼠肝细胞，导致甲状腺上皮细胞液泡化，减少甲状腺激素的合成与释放，降低四碘甲状腺原氨酸( T4)水平，增加甲状腺刺激激素(TSH) 水平。对血液学参数检测发现，红细胞总数、血红蛋白数量、血细胞比容、平均红细胞浓度显著下降。B6C3F1 小鼠血液中红细胞容积和网状细胞数量都增加。此外孔雀石绿能抑制血浆胆碱脂酶的活性，进而
造成乙酰胆碱的蓄积而出现神经症状。

应用^[3]

孔雀绿常被用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色剂，因其能有效预防水产品真菌感染和杀死寄生虫，1933年起作为驱虫剂、杀虫剂、防腐剂在水产中使用，后曾被广泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。从上世纪90年代开始，国内外学者陆续发现孔雀绿能引起鱼类的鳃和皮肤上皮细胞轻度炎症；使肾管腔有轻度扩张，肾小管壁细胞的胞核也扩大；具有致突变、致畸、致癌等危害。

检测方法^[3]

目前，MG 的检测方法主要有高效液相色谱法-紫外检测法，高效液相色谱-安培法、高效液相色谱法-质谱联用法、酶联免疫法毛细管电泳法等。高效液相色谱法紫外 检测，MG 的响应相对较低；利用MG能被硼氢化钾还原为隐色孔雀石绿(LMG)，LMG 具有荧光 响应的特点，采用高效液相色谱法-荧光检测法进行分析检测，有助于提高MG残留检测的 灵敏度。

有研究提供一种分离分析大体积环境水样中微量孔雀绿的方法。具体步骤为：

1)采用高内相乳液聚合技术合成具有亲水性的聚苯乙烯STY-二乙烯苯DVB-甲基丙烯 酸缩水甘油酯GMA高内相乳液聚合整体柱，即STY/DVB/GMA polyHIPE整体柱。

2)在300mL环境水样品中加入3mL甲酸使环境水样品呈酸性，再加入3mL浓度为 0.04mol/L 的硼氢化钾还原孔雀绿，所得混合液在蠕动泵或高压泵的作用下以2mL/min的 流速通过步骤(1)制得的STY/DVB/GMA polyHIPE整体柱，萃取并富集环境水样品中存在的 痕量还原型孔雀绿（L MG）。

3)采用体积比为1：4的PBS/乙腈混合溶液清洗STY/DVB/GMA polyHIPE整体柱，除 去吸附力小的干扰物质，再用体积比为1：1的乙醇/三氯甲烷混合溶液洗脱富集在STY/DVB/ GMA polyHIPE整体柱上的孔雀绿目标物，收集洗脱液放入进样瓶，用高效液相色谱-荧光光 谱联用分析测定，即实现对大体积环境水样中微量孔雀绿的分离分析。

本方法采用高内相乳液（HIPE）法，制备了新型STY/DVB/GMA polyHIPE整体柱，整体柱比表面积大，孔径较小，孔间通道数目多，形成巨大相互贯通的蜂窝结构。

本发明方 法操作简单、重复性好、灵敏度高，检测结果可靠，可应用于各种环境水样品中痕量MG的准 确检测。经过对单体比例的调控、相比的优化，使得乳液稳定性增加，乳液不断变粘稠，获得了吸附性强、流通性好、稳定性与重现性好的高内相乳液聚合物整体柱；对孔雀绿或还 原型孔雀绿具有高的萃取和富集能力，可应用于复杂水体样品中痕量孔雀绿的选择性萃取、富集和分析；采用硼氢化钾还原样品中孔雀绿，使其能采用高效液相色谱-荧光光谱仪（HPLC-FLD）方法进行定性定量分析，实现了大体积环境水样中孔雀绿的高灵敏、超微量准确分析。

主要参考资料

[1] CN201510223264.8 一种降解孔雀绿废水的方法

[2] 翟毓秀, 郭莹莹, 耿霞, 等. 孔雀石绿的代谢机理及生物毒性研究进展[J]. 中國海洋大學學報 (自然科學版), 2007, 37(1): 27-32.   

[3] CN201710512070.9 一种分离分析大体积环境水样中微量孔雀绿的方法