苯丙氨酸解氨酶(PAL)试剂盒的应用

背景^[1-3]

苯丙氨酸解氨酶(PAL)试剂盒可以用于体外样本苯丙氨酸解氨酶(PAL)的含量检测。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中苯丙氨酸解氨酶(PAL)水平。用纯化的苯丙氨酸解氨酶(PAL)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入苯丙氨酸解氨酶(PAL)，再与HRP标记的苯丙氨酸解氨酶(PAL)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中苯丙氨酸解氨酶(PAL)浓度。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)试剂盒

操作步骤：

1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

测定应在加终止液后15分钟以内进行。测定意义：PAL（EC4.3 1 5）广泛存在于各种植物和少数微生物中，是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切相关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。

应用^[4][5]

用于石斛苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及表达分析研究

PAL—苯丙氨酸解氨酶，是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶，以铁皮石斛为实验材料，克隆出铁皮石斛的DcPAL基因，进而使其在大肠杆菌中的成功表达及荧光定量检测其在不同组织中转录水平的表达量，为深入研究苯丙氨酸解氨酶的结构与功能以及理清其次生代谢途径奠定基础。

研究主要取得结果如下：1.石斛PAL苯丙氨酸解氨酶基因的克隆通过同源克隆和RACE相结合的方法，从石斛中克隆了苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因的全长cDNA，命名为DcPAL（GenBank登录号为JQ765748）。DcPAL全长2458bp，开放阅读框2142bp，编码713个氨基酸。经氨基酸序列多重比较发现,DcPAL编码的氨基酸序列与蝴蝶兰等植物的PAL氨基酸序列同源性大于90%，DcPAL编码的氨基酸序列包括与拟南芥、烟草等PAL蛋白质一样的脱氨基位点和催化活性位点。DcPAL氨基酸序列的PAL系统进化树分析结果显示,DcPAL编码的氨基酸序列与兰科类植物（如蝴蝶兰）的PAL聚为一支,说明两者的亲缘关系较近。

2. DcPAL基因荧光定量的表达分析通过荧光定量分析结果表明，DcPAL基因在石斛原球茎、根、假鳞茎、叶中均有表达。其中，原球茎和叶片中表达量较低且差异不明显，茎和根中有较高的表达量。

3.原核表达载体构建已经成功构建了含有目的基因的原核表达载体原核表达载pETDuet-1/PAL，并实现石斛PAL在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达。

参考文献

[1]Inhibitory Effects of Dendrobium Alkaloids on Memory Impairment Induced by Lipopolysaccharide in Rats[J].Yanfei Li,Fei Li,Qihai Gong,Qin Wu,Jingshan Shi.Planta Med.2011(02)

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[3]Neuroprotective effects of Dendrobium alkaloids on rat cortical neurons injured by oxygen-glucose deprivation and reperfusion[J].Q.Wang,Q.Gong,Q.Wu,J.Shi.Phytomedicine.2009(2)

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[5]姚瑶.石斛苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及表达分析[D].安徽农业大学,2013.