大鼠基质金属蛋白酶13(MMP-13)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

大鼠基质金属蛋白酶13(MMP-13)ELISA KIT用于检测血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等样本中基质金属蛋白酶13(MMP-13)的含量。

实验原理：

基质金属蛋白酶13(MMP-13)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中基质金属蛋白酶13(MMP-13)水平。用纯化的基质金属蛋白酶13(MMP-13)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入基质金属蛋白酶13(MMP-13)，再与HRP标记的基质金属蛋白酶13(MMP-13)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的基质金属蛋白酶13(MMP-13)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中基质金属蛋白酶13(MMP-13)浓度。

大鼠基质金属蛋白酶13(MMP-13)ELISA KIT

检测步骤：

1．将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20-25℃）平衡30 min以上,注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2．按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷冻。

3．加标准品/样本50μL/孔，然后加入抗体工作液50μL/孔，再振荡混匀，用封板膜盖板，37℃反应30 min。

4．洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。

5．加入酶标记物100μL/孔，用封板膜盖板，37℃反应20 min。

6．洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。

7．显色：每孔加入底物缓冲液50μL，再加底物液50μL，轻轻振荡混匀，37℃环境避光显色10 min。

8．测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450 nm处（在20 min内读完数据），测定吸光度值。

结果计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

应用^[4][5]

用于乌梅透骨汤对MAPK通路调控大鼠软骨基质金属蛋白酶表达影响的研究

给予骨性关节炎模型大鼠灌胃不同浓度的乌梅透骨汤,探讨乌梅透骨汤对MAPK通路调控大鼠软骨基质金属蛋白酶表达影响,从分子生物学角度对该方剂治疗骨性关节炎的机理进行研究。

方法:本实验选择200只体重为180-200g的健康Wistar大鼠,在进行骨性关节炎造模后,对其给予高、中、低剂量的乌梅透骨汤进行灌胃,并测量给药前后大鼠的关节软骨组织含水率,观察膝关节形态,对引起关节炎症反应的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路相关炎症因子:肿瘤坏死因子--α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-10（IL-10）变化进行研究,探讨软骨组织中基质金属蛋白酶相关基因MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-9、金属蛋白酶组织抑制因子-3（TIMP-3）的表达,以及对MAPK信号通路相关基因p38、细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase,ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）的表达进行检测。

结果:模型组和低剂量组大鼠的软骨基质受到破坏较重,渗透压增加,软骨基质的含水率显著高于空白组、高剂量组和中剂量组（P<0.05）。模型组炎性细胞浸润明显,血管扩张,滑膜增生,软骨组织破坏,关节组织破坏严重,而各给药组膝关节组织则有被修复的趋势,且药物剂量越高,效果越明显。

模型组各促炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和炎症抑制因子IL-10显著升高（P<0.05）,在给大鼠灌胃药剂后,各炎性相关因子都会随给药剂量的增加而显著降低（P<0.05）。模型组大鼠软骨组织的基质金属蛋白酶相关基因MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-9、TIMP-3和MAPK信号通路相关基因p38、ERK、JNK的表达量显著高于健康大鼠（P<0.05）,在进行灌胃治疗后,相关基因的表达随药物剂量的增加而显著降低（P<0.05）。

结论:乌梅透骨汤对软骨组织基质有显著的保护和修复作用,通过调控MAPK的信号通路抑制骨关节炎中的炎性因子,从而抑制骨性关节炎出现的炎症反应,并且通过调控MAPK的方式下调基质金属蛋白酶的相对表达量,减少骨性关节炎对软骨组织造成的损伤。

参考文献

[1]miR-940 regulates the inflammatory response of chondrocytes by targeting MyD88 in osteoarthritis.[J].Cao Jian,Liu Zhongxing,Zhang Limin,Li Jinlong.Molecular and cellular biochemistry.2019(1-2)

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[5]岳馥鸿.乌梅透骨汤对MAPK通路调控大鼠软骨基质金属蛋白酶表达影响的研究[D].哈尔滨医科大学,2020.