蛋白电泳固绿染色试剂盒的应用

背景^[1-3]

蛋白电泳固绿染色试剂盒提供一种蛋白质PAGE凝胶电泳快速染色试剂盒及其染色方法,属于蛋白质分析检测技术领域,试剂盒包括HSC染料一系列试剂,HSC染料二系列试剂和水;所述的HSC染料一系列试剂包括无水乙醇和磷酸;所述的HSC染料二系列试剂包括考马斯亮蓝G250,硫酸铵,磷酸,甲醇,硫酸铝,通过HSC染料一固定后再使用HSC染料二染色。

蛋白电泳固绿染色试剂盒

蛋白电泳作用机理

蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷，为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理(上样缓冲液)。即在样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。

电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。

当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。

电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8的上层，pH8.8的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。出现了pH不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，甘aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（pH6.8）Cl¯>Pro¯>—COO¯。在Cl¯与Pro¯之间和Pro¯与—COO¯之间都将出现低离子区，同时也出现高电势，高电势迫使Pro¯向Cl¯迁移，—COO¯向Pro¯迁移。

如：一个Cl¯领路，—COO¯推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。在浓缩胶运动中，由于胶联度小，孔径大，Pro¯受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分离胶时，此时Pro¯，Cl¯，甘aa离子在pH8.8的溶液中，Cl¯完全电离而很快到达正极，甘aa电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。

由于Pro¯在电泳过程中，受到溶液离子的变化而pH值发生变化，但每一瞬间，其所带电荷数除以单位质量是不同的，所以带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应。由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。

应用^[4][5]

用于利用唐鱼卵黄蛋白原作为生物标志物检测环境内分泌干扰物的研究

通过分离纯化唐鱼卵黄脂磷蛋白（Lv）作为抗原制备抗血清；人工诱导雄性唐鱼产生卵黄蛋白原（Vtg），并将其提取纯化；用免疫印迹检测唐鱼Vtg与Lv之间是否具有相同免疫原性；从而以Lv抗血清为抗体，Lv为标准品建立测定唐鱼体内Vtg含量的间接酶联免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）方法；最后应用该法检测经滴滴涕（DDTs）暴露处理的雄性唐鱼体内的Vtg含量，以探究DDTs的雌激素效应，以及证实唐鱼是否适合作为检测环境雌激素的理想实验动物，为今后把唐鱼培育成监测环境污染物的指示生物奠定基础。

采用Native-PAGE和SDS-PAGE方法从性成熟雌性唐鱼（Tanichthys albonubes）卵巢组织提纯了卵黄脂磷蛋白（Lv）。已确定被纯化的唐鱼Lv在Native—PAGE（4-7.5％）电泳中分子量为314kD，蛋白条带分别可被苏丹黑B、高碘酸-Shiff试剂、甲基绿染色，证明唐鱼Lv是一种富含糖、脂、磷的蛋白质。用纯化的唐鱼Lv免疫大白鼠获得鼠源多克隆抗血清。

以Native-PAGE和SDS-PAGE制备的唐鱼Lv及裂解后的组分作为抗原所制备的抗血清与经17β-雌二醇（E2）诱导的雄性唐鱼、去除卵巢的雌性唐鱼以及唐鱼卵巢的匀浆液能发生免疫反应，并且印迹位置与雌性特异蛋白卵黄蛋白原（Vtg）的位置相当。但是两种血清和未经E2诱导的雄鱼整体匀浆液并无反应，显示Lv及其98kDa大分子亚基的抗血清与Vtg和Lv两种蛋白是特异结合的。

结果表明，唐鱼Lv裂解组分的抗血清可用于检测唐鱼的Vtg。以Native-PAGE分析经过浓度为50μg／L E2诱导的雄性唐鱼整体匀浆液，结果表明，雄性唐鱼产生了雌性特异蛋白Vtg，并且在体内积累。利用Mg2+-EDTA选择性沉淀和Q Sepharose阴离子交换层析的两步纯化方法可以分离纯化唐鱼Vtg。经Native-PAGE鉴定，唐鱼Vtg的分子量为440kDa。以唐鱼Lv抗血清为抗体，Lv作为标准品建立间接酶联免疫吸附（ELISA）方法，可用于检测整体匀浆中Vtg的含量。

该方法的检测工作范围为3.26～209.25ng／mL，Lv抗血清稀释度为1：3200，批内误差为8.59％，批间误差为6.28％，灵敏度为8.1ng／mL。在此范围内，标准曲线具有良好的线性和重复性。运用该方法检测经过不同浓度DDTs暴露20d的雄性唐鱼体内的Vtg含量。

结果表明，在低浓度DDTs作用下，可以诱导雄性唐鱼产生Vtg。当暴露DDTs浓度为0.0275mg／mL、0.0137mg／mL和0.0067mg／mL时，雄性唐鱼体内Vtg含量分别为1109.43μg／g、911.16μg／g和1322.79μg／g，与溶剂对照组462.79μg／g存在显著差异（p＜0.05）。证明DDTs具有雌激素性质，也表明唐鱼卵黄蛋白原适合作为监测环境EDCs的理想生物标志物。

参考文献

[1]Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice:enhancement of the methamphetamine-induced abuse state[J].T Suzuki,K Mizuo,H Nakazawa,Y Funae,S Fushiki,S Fukushima,T Shirai,M Narita.Neuroscience.2003(3)

[2]Postnatal exposure of 2,2′,3,3′,4,6′-hexachlorobiphenyl and 2,2′,3,4′,5′,6-hexachlorobiphenyl on sperm function and hormone levels in adult rats[J].Ping-Chi Hsu,Mei-Hui Li,Yueliang Leon Guo.Toxicology.2003(2)

[3]Route of exposure affects the oestrogenic response of fish to 4-tert-nonylphenol[J].Karen A Pickford,R.Emma Thomas-Jones,Brian Wheals,Charles R Tyler,John P Sumpter.Aquatic Toxicology.2003(3)

[4]Comparative responses of molluscs and fish to environmental estrogens and an estrogenic effluent[J].S Jobling,D Casey,T Rodgers-Gray,J Oehlmann,U Schulte-Oehlmann,S Pawlowski,T Baunbeck,A.P Turner,C.R Tyler.Aquatic Toxicology.2003(2)

[5]姚静.利用唐鱼卵黄蛋白原作为生物标志物检测环境内分泌干扰物的研究[D].华南师范大学,2007.