蜡样芽孢杆菌的检测

背景^[1][2]

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种革兰氏阳性大杆菌，主要分布于空气、尘埃、土壤、水及植物中，能产生抗逆性内生芽孢。与营养体细胞相比，芽孢对热的抗性高 105 倍或更多，对紫外线和离子辐射的抗性高100 多倍，对抗菌素及其他化学药品的抗性也高，能够抵御各种不良环境。

除个别菌种外，大多数菌种与动植物关系密切并形成良好的共生体系，能料、农业、医药保健和食品等各领域有着极其广泛的应用：农业上用作生防制剂；牧渔养殖业上用作饲料添加剂；医药业上用于人类胃肠道疾病的防治、降血脂、抗衰老、防止细菌移位、抗肿瘤及自身免疫性疾病防治。众多研究发现，蜡样芽孢杆菌是土壤中优势菌，对植物根际有促生、防病等功效，属于目前研究得比较多的植物根际促生菌 (PGPR)。

为了解芽孢杆菌生态条件、不同环境下种群结构及优势种，以便选择有针对性的优势菌种和组合的防病增产种群，对全国 10 个省市 13 个地区的 5 种作物根际土及 5 种作物种子进行分离，获芽孢杆菌分离株 361 株，选出 100 株进行鉴定。结果发现其中有蜡样芽孢杆菌 61 株，说明蜡样芽孢杆菌对生态条件适应性最强，为土壤中优势菌。

此外，很多蜡样芽孢杆菌是一些谷类作物、蔬菜及树木的内生菌，能在植物活体内定植，对寄主植物不产生任何危害并与其建立和谐关系，促进植物生长，减少病害虫害，提高植物抵御不良环境的能力并减少化肥使用量。已分离得到的植物内生菌包括50 多个属，其中应用较多的是芽孢杆菌属和假单胞杆菌属。利用有益内生芽孢杆菌来达到增产、防病的目的成为当今该领域研究的一个热点。

致病性 ^[3][2]

蜡样芽孢杆菌是一种无荚膜，能运动，产芽孢，兼性好氧的革兰氏阳性杆菌。 蜡样芽孢杆菌可产生致吐、致腹泻的肠毒素，人在食用被蜡样芽胞杆菌污染的食品后，一般在8～16 h 内出现呕吐或腹泻，或两者兼有的中毒症状。偶尔能导致眼部感染，心内膜炎、脑膜炎和菌血症等疾病。蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒临床现为发病急，来势猛，主要症状为恶心、呕吐和腹泻。

根据蜡样芽孢杆菌产生呕吐毒素和腹泻毒素，可分为呕吐型综合症和腹泻型综合症两类。蜡样芽孢杆菌的主要毒力因子包括：与呕吐毒素相关的非核糖体多肽合成酶系(NRPS) 基因；与腹泻毒素相关的溶血素BL基因( hblA、hblC和hblD )、非溶血性的肠毒素Nhe 基 因(nheA、nheB和nheC)、肠毒素FM基因( entFM )、肠毒素T基因 ( ceT)和细胞毒素K基因( cytK )。

因为蜡状芽孢杆菌广泛存在于土壤、空气、水和尘埃中，所以无法避免地会污染食品。如乳制品在加工、运输、储存等环节均易受蜡样芽孢杆菌污染，该菌可以通过泥土、灰尘、昆虫、不洁用具和从业人员的手而传播，研究表明食品中蜡样芽孢杆菌污染程度为104 CFU/mL时就会对人体造成潜在的健康威胁从而不适于消费者食用，当菌落含量超过105 CFU/mL时，就有可能爆发食物中毒事件。

在1986~2007年发生的227起蜡样芽孢杆菌呕吐型食物中毒事件，有2.6%是由乳及乳制品引起的，34起腹泻型食物中毒事件5.9%是由乳及乳制品引起的，这其中不包括被误当做乳糖不耐症而被忽视的。婴幼儿免疫功能低，曾报道1例试用婴幼儿配方奶粉引起的腹泻检出蜡样芽孢杆菌，其菌落总数为160CFU/g，远低于105 CFU/mL，亦能致病。其中有2起是婴儿奶粉和2起利乐包包装的椰子奶。

应用^[4]

Bacillus cereus 能促进植物生长且对多种植物病害有明显的抑制作用。目前生产上使用的增产菌株 83–10、A–47、M22 等均为蜡样芽孢杆菌。从水稻里筛选的一株蜡样芽孢杆菌能促进水稻早熟、生长，控制病害，增加产量。菌株 Bacillus cereus UW85 对苜蓿苗、烟草苗、黄瓜和花生等植物的病害、腐败等均有良好疗效。

但并不是所有的蜡样芽孢杆菌都对植物产生有益作用，1996 年发现小麦体内的有害蜡样芽孢杆菌能引起植物出苗不齐、生长缓慢、发育不良、叶尖易变黄并有扭曲苗出现等。在番茄内生细菌的研究中也发现其能产生有害作用。因此，要将蜡样芽孢杆菌应用于农业，必须进行多项严格的生理学、生物学实验，筛选出有益菌种。若用各种诱变手段来改良有益菌种，也必须在诱变之后进行各项实验，确保诱变菌种对植物无害。

检测^[1]

1. 常规鉴定方法

传统检测方法是将分离培养后的可疑菌落做生化反应试验，溶血试验，协同溶血试验，动物试验，典型运动等鉴定，被确定为蜡样芽孢杆菌后进一步进行
血清分型。目前我国常用的蜡样芽孢杆菌的检验方法是国标法 GB4789.14-2003，以及行业标准 SN/T0176-1992（进出口食品蜡样芽孢杆菌检验方法）和SN/T 255211-2010（乳及乳制品微生物学检验方法）。

目前检测方法中常用的选择性培养基主要有蜡样芽孢杆菌选择琼脂（PEMBA）、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养 基 （MYP），显色养基主要是BCM。PEMBA已经是国际化标准组织（ISO）公认的检验蜡样芽孢杆菌的选择性培养基，主要用于临床样本 。MYP广泛用于蜡样芽孢杆菌的分离和计数。 BCM和MYP相比菌落技术和分离更容易，有较高选择性，能形成离散的不连在一起的菌落

2. 快速检测方法

1）PCR法

A：普通PCR方法：设计了16S核糖体RNA的引物，以此为基础建立PCR来定量检测。通过扩增致病性蜡样芽孢杆菌的hblA基因实现对蜡样芽孢杆菌的
快速检测。普通PCR电泳法和实时荧光PCR法比较结果如下：

B：环介导等温扩增技术：开发了环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测蜡样芽孢杆菌的方法。 该法以蜡样芽孢杆菌溶血素基因的hblA 基因的保守序列设计引物，将FTA 滤膜提取DNA 与LAMP 法相结合，检测蜡样芽孢杆菌和人工污染蜡样芽孢杆菌的消毒乳。LAMP 方法检测灵敏度高，蜡样芽孢杆菌的检出限为4.4 mL-1，比PCR检测灵敏度高10 倍；人工污染消毒乳中蜡样芽孢杆菌的检出限57 mL-1。

C：PCR—DHPLC法：应用PCR结合变性高效液相色谱技术对食品中污染的蜡样芽孢杆菌进行快速准确的检测。该法是根据蜡样芽孢杆菌gyrB特异基因序列的特点设计特异性引物，PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。 结果表明该方法具有很高的特异性，灵敏度高，检出限可达10 mL-1，快速简便。

D：微生物专用酶快速反应系统的检测技术：利用特异性酶法鉴定致病菌的特点，设计了一种用来检测食品中蜡样芽孢杆菌的显色快速检测方法。该法利用特异性酶反应原理，设计了蜡样芽孢杆菌显色培养基（HKCB），通过人工污染样品和实际样品检验，分析，结果表明显色培养基HKCB与传统平板MYP可以达到相同的检测限和灵敏度，且具有较高的特异性。

F：免疫学方法：检测蜡样芽孢杆菌肠毒素的免疫学方法主要有免疫乳胶凝集试验、反向简介凝血试验、反向被动乳胶凝集试验、放射免疫法、免疫荧光技术、酶联免疫测试技术及免疫印迹法等。用蛋白印记技术（Colony Blot Immunoassay，CBI）快速检测蜡样芽抱杆菌的方法。

芽孢杆菌防控措施^[2]

蜡状芽孢杆菌污染牧场环境和生乳，既有致病性，也影响牛奶的质量，可造成牛奶的 “甜 酪 ”和 “凝结乳脂”现象，导致淡炼乳出现凝块、苦味、酸味和腐败味。要防止蜡样芽孢杆菌污染乳制品，尤其是防止婴幼儿奶粉的污染，预防可能危害人体健康的潜在危险产生，就必须从原料乳开始，对生产的各个环节，可能产生污染的各种可能性进行分析，并制订相应的预防措施，建立监测方法，将原料乳生产中微生物指标提前控制，尤其要控制芽孢的数量，使其危害程度降到最低。

建立并严格执行行之有效的HACCP（危害分析和关键控制点）系统，并把肠杆菌科作为生产线的卫生指标菌。要防止蜡样芽孢杆菌的污染，必须在乳制品加工过程中对各个环节进行严格消毒，同时通过适当巴氏杀菌、超高温杀菌或其他高温工艺可彻底的杀灭该菌。

主要参考资料

[1] 蜡样芽孢杆菌食物中毒的研究进展

[2] 赵月明, 任国谱. 乳制品中蜡样芽孢杆菌的研究进展[J]. 中国乳品工业, 2014, 42(4): 46-49.

[3] 庄子慧, 何丽, 郭云昌, 等. 我国食源性蜡样芽孢杆菌毒力基因和药物敏感性研究[J]. 中国食品卫生杂志, 2013, 25(3): 198-201.

[4] 管珺, 胡永红, 杨文革, 等. 蜡样芽孢杆菌防治植物病虫害的研究进展[J]. 現代農藥, 2007, 6(4): 7-10.