福氏志贺氏菌的致病机制

背景^[1][2]

志贺氏菌又称为痢疾杆菌，属于革兰氏阴性兼性细胞内致病菌，临床上可引起细菌性痢疾。世界各地都有菌痢流行，全球每年的发病人数达到 2 亿，其中 95%以上的死亡人数发生在发展中国家，我国每年菌痢的发病人数在 40 万以上，仅次于肝炎和结核。志贺氏菌属共有四个种 48 个血清型，包括痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）、宋内氏志贺氏菌（Shigella sonnei）和鲍氏志贺氏菌（Shigella boydii），福氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌常引起暴发和流行，鲍氏志贺氏 菌主要引起重症菌痢。

近年来，随着中国疾病预防控制中心等单位联合完成的痢疾杆菌福氏 2a 志贺氏菌全基因组测序的完成，对其致病机理的研究也不断深入，但是临床多重耐药菌株的出现，增加痢疾防治的难度，因此开展对痢疾病原菌的遗传机制和致病机理研究，对开发研制有效的疫苗和新药具有重要价值。

致病基因^[1]

志贺氏菌的毒力基因位于毒力大质粒和染色体上。所有志贺氏菌型表达完全的毒力均需有大质粒的存在，质粒控制着志贺氏菌的侵袭力，但完成完整的致病过程则需要染色体和大质粒上多个基因协同作用。

1.大质粒上的毒力相关基因

有毒力的志贺氏菌都含有一个毒力大质粒，消除该质粒后，志贺氏菌致病能力丧失。志贺氏菌毒力大质粒是 1979 年首次从福氏志贺氏菌 2a 中检测到并得到了确认。志贺氏菌毒力大质粒上除含编码Ⅲ型分泌系统的 mxi-spa 基因座以及侵袭相关基因 ipa（ipaABCD）外，主要还有 stb 和 rep 基因，分别与质粒的稳定保持和复制有关。

毒力大质粒上的侵袭相关基因 ipa（ipaABCD） 编码产生 IpaA、B、C、D 4 种蛋白，其中，IpaB、C、D 3 种蛋白是细菌侵入上皮细胞所必 需的。virF 基因位于福氏 2a 志贺氏菌 140MDa 大质粒上约 12.0 kb 的 SalI F 片段上而得名，是指刚果红结合基因，其产物对质 粒毒力的正向调节起关键作用，可以直接激活 virG 基因的转录，并通过 virB、ipaR 或 invE 基因间接激活 ipaABCD 和 mxispa 基因座的转录。

virB 基因位于福氏志贺氏菌 140MDa 大质粒的 SalIB 片段上，virB 为志贺氏菌福氏 2a 侵袭表型的调节基因，virB 的转录受 virF 的正向调节。 大质粒上的 ics 基因为细菌在细胞内和细胞间扩散所必需。icsA 基因可编码 120kDa 的外膜致免疫蛋白，而且 icsA 位 点与 virG 位点相似，提示 icsA 基因和 virG 基因为同一基因。另外，ics 基因上的另一组成部分是 icsB 基因，为细菌在宿主细胞间扩散所必需，其表达受 virB 的调控。

icsB、ics A（或 virG）和 kcpA 共同决定细菌的扩散能力，而又间接受 virB、virF 的调节。virG 基因位于福氏 2a 志贺氏菌 140MDa 大质粒上的 10.3kb SalI G 片段上，virG 基因产物是志贺氏菌福氏 2a 中被认定的第 5 个质粒侵袭抗原，该蛋白位于细菌的表面。virG 基因编码着细菌侵入细胞后向周围细胞的扩散的能力。ipa、mxi-spa、ics、virB 等基因的表达是受温度、pH 值、渗透压等多种因素调控的。

在福氏志贺氏菌的各种血清型中，5 个完整的或部分 ipaH 基因拷贝存在于侵袭性大质粒上，这些基因包括 ipaH9.8、ipaH7.8、ipaH4.5、ipaH2.5 和 ipaH1.4，与毒力大质粒上 的其他基因不同，ipaH 基因的表达不依赖于温度的调节，也不需要 virF 的诱导。ipaH 的基因产物可以阻止血小板吸附到创面内皮下，还可调节宿主对志贺氏菌的反应，如抑制正常凝集作用的形成，并且促使水肿的形成。

2. 染色体上的毒力相关基因

除了侵袭大质粒的核心毒力编码区外，许多染色体上的基因也参与了致病过程。与毒力相关的染色体基因按其功能可以分成两类：一类是细菌在肠道和 组织感染中存活所必需的基因，如编码铁摄取系统的基因（iutA 和 iucABCD）、超氧化物歧化酶（sodB）以及某些重要代谢途径中的基因（aroABCD、purE、guaBA 和 dapB）；第二类是调节质粒上毒力基因表达的调控基因，如毒力调控基因 virR 和渗透压蛋 白基因 malA（ompR 和 envZ），其中VirR 编码一个与 H-NS 相似的组蛋白样分子，可调控 Ipa 和 Mix-Spa 依赖于温度的表达。

福氏志贺氏菌2a Hfr 株与大肠杆菌 K12 的杂交实验表明，志贺氏菌 iucABCD 基因座编码亲水产气菌素铁载体，iutA 基因编码 1 个 76kD 的受体蛋白，与 tnaA 基因相连。除痢疾Ⅰ 型志贺氏菌外，其他志贺氏菌多含上述基因。

致病机制 ^[1]

志贺氏菌是一类具有高度传染性的微生物，人工感染实验表明，少至 10 个细菌即可引起成年人发病。人在接触痢疾病人的粪便或食用含有志贺氏菌的食品和饮水后，一些细菌在胃部 酸性环境中生存下来，穿过小肠后到达结肠，浸入结肠粘膜引起急性坏死性结肠-直肠炎，临床表现为发热、肠痉挛、排带粘膜 血便。粪便中含有大量的多形核白细胞是该病的特征，有力地说明为溃疡型结肠炎的急性形式。

志贺氏菌专门侵袭直肠和结肠粘膜的机制还不清楚。有人推测志贺氏菌表达一个结肠特定的粘附系统，有的则认为是由于直肠和结肠粘膜在志贺氏菌存在的情况下对急性水肿异常敏感导致的。

1）志贺菌的Ⅲ型分泌系统：

在很多致病菌中发现存在Ⅲ型系统，如耶尔森氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、大肠杆菌属、鲍特氏菌属以及绿脓假单细胞、肠致病性大肠杆菌等。致病菌通过Ⅲ型系统粘附于真核细胞的表面，通过双层膜和真核细胞膜，将细菌蛋白注入细胞并破坏和扰乱宿主细胞的生物学功能 福氏志贺氏菌Ⅲ型分泌系统包括一个分泌装置，它由大约由 25 个蛋白组成，同时还包括由该装置释放的一系列蛋白。

这些释放的蛋白一部分为效应子，被输送到靶细胞质中，另一部分则为转位子，其功能为协助效应子通过真核细胞膜。大多数 的效应子作用于细胞内的信号调节级联系统。福氏志贺氏菌Ⅲ型分泌系统分泌大约 20 个效应分子，其中 IpaA、IpaB、IpaC、IpaD 以及 IpgD 的分泌量最多。

以下是研究较多的已知效应分子：IpaA：主要作用是促进细菌的内化过程。联结蛋白 （vinculin） 是一个连接宿主细胞肌动蛋白骨架和细胞膜的结构蛋白，IpaA 能够与其结合，促进肌动蛋白解聚。IpaA-联结蛋白之间的相互作用能够引发细菌入侵宿主所需的类黏着斑状结构的形成。

2）志贺氏菌的侵袭机制：

福氏志贺氏菌的致病过程可以简要总结为通过胃肠屏障到达结肠、侵入结肠上皮细胞、细菌开始增殖并向邻近细胞扩散、引起炎症、上皮细胞死亡、溃疡、结肠内的液体增多产生脓血及黏液等几个步骤。这个过程中的分子机理十分复杂，虽然目前的研究成果还不能全面揭示其致病本质，但其中细菌侵袭及穿过结肠粘膜的过程己基本清楚。福氏痢疾杆菌经口摄入后，经胃肠屏障到达结肠，先粘附到肠道粘膜表面派伊尔氏淋巴小结上的 M 细胞上，通过 M 细胞进入上皮下淋巴组织，在那里被巨噬细胞吞噬。

福氏志贺氏菌能够逃离吞噬体并诱导巨噬细胞凋亡，释放出细胞因子 IL- 1β。细菌从死亡的巨噬细胞中释放出来，从肠上皮细胞的基底面侵入细胞，细菌与上皮细胞接触后激活Ⅲ型分泌系统，分泌侵袭性蛋白，效应蛋白通过由 IpaB 和 IpaC 形成的孔道分泌到上皮细胞的细胞质中。其中，IpaC 能够引发肌动蛋白聚合，加速细菌内化过程；IpgD 负责解离细胞质膜与肌动蛋白骨架之间的连接；VirA 造成细胞微管结构解离；IpaA 能与联结蛋白（vinculin）形成复合体，促进肌动蛋自解聚。这样，细菌接触到的细胞表面就会发生延展，逐渐形成包裹细菌的空泡 （vacuole），从而使福氏志贺氏菌进入上皮细胞。

进入上皮细胞后，IpaB 和 IpaC 能够裂解掉包裹细菌的空泡，将福氏志贺氏菌释放到上皮细胞的细胞质中。随后，外膜蛋白 IcsA 出现在细菌的一端，逐渐募集联结蛋白和肌动蛋白，形成一个聚合的肌动白尾巴，推动细菌穿过细胞质到达细胞膜。这种推动力在接触到细胞膜时，会造成一个伸向临近上皮细胞的突起，随后 IpaB 和 IpaC 裂解掉两层膜，将福氏志贺氏菌释放到临近的上皮细胞中。

此外，细胞内的福氏志贺氏菌能够诱导上皮细胞释放出 IL-8 与凋亡巨噬细胞释放的 IL-1β 能募集多形核细胞，并诱导它们从上皮细胞层迁移到肠腔内。随着这个迁移过程，上皮细胞层的紧密连接将被破坏，更加有利于福氏志贺氏菌的入侵。并且，上皮下组织的巨噬细胞凋亡使细菌得以存活并引起水肿，结果使上皮结构破坏，加速细菌进一步进入细胞内。痢疾杆菌侵袭上皮细胞后，引起局部炎症反应和多型核白细胞浸润，破坏上皮细胞间的紧密连接，细菌可以直接通过上皮细胞间的间隙接触接触上皮细胞的基底膜侵入上皮细胞，最终导致上皮屏障功能完全丧失。

耐药性^[2]

对46株福氏志贺氏菌分离株进行分子分型，同时了解分离株的耐药状况。利用NotⅠ酶对46株福氏志贺氏菌进行脉冲场凝胶电泳分子分型试验，所得图谱用BioNumerics Version软件进行聚类分析；采用MIC法并利 用全自动药敏接种判读仪（AIM-Vizion）对46株福氏志贺氏菌分离株进行耐药分析。结果显示46株菌对氨苄西林、环丙沙星、萘啶酸、四环素耐药性为100%，对氯霉素耐药性在97.8%，对亚胺培南、头孢西、庆大霉素耐药性为0，对头孢噻肟耐药性为8.7%。

虽然 46 株福氏志贺氏菌对亚胺培南、头孢西丁、庆大霉素均敏感，但临床发现，使用三代头孢菌素治疗 3~4 天后，原本对这些抗生素敏感的菌株可能会产生耐药性。根据近年的细菌耐药性监测数据，与10 年前相比，志贺氏菌的耐药性已发生了很大变化。

检测方法^[3]

常见细菌检测方法有传统生化检测、聚合酶链反应（PCR）技术、酶联免疫法、传感器技术、基因芯片技术、脉冲场凝胶电泳法。常规生化检测检验步骤繁琐、耗时长、准确性低。PCR技术费用昂贵，分析时间长。酶联免疫方法影响因素太多、假阳性率高。生物传感器技术、基因芯片技术费用高，不利于推广。脉冲场凝胶电泳假阳性高。

随着新兴技术的发展，作为新型荧光标记材料的量子点，主要是由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的稳定的、尺寸在1nm~100nm的纳米晶体。相对于有机荧光标记物，量子点的激发光谱宽而且呈连续分布，同时荧光发射光谱的半宽 峰窄且对称分布。此外，量子点还具有非常好的量子产额、耐光漂白的稳定性好、背景噪声小以及荧光寿命长等优。基于以上优点，该研究使用量子点作为荧光生物标记物。

有研究基于抗原抗体反应捕获目标菌，结合生物素与亲和素间的特异性相互作用，联合免疫纳米磁珠磁性分离、免疫量子点荧光标记技术，运用荧光检测系统，建立了福氏志贺氏菌的定量检测模型。

结果表明，福氏志贺氏菌菌浓度为102 CFU/mL~105 CFU/mL， 相对荧光强度与菌浓度关系为FI=12.78lgN+15.941，呈良好的线性关系，决定系数R2 =0.9761。进一步对模型的准确度和精确度进行验证，得到菌落浓度预测值与真实值差异小，检测相对标准偏差为1.8%，表明模型的准确度好，精密度高。该方法可简单、快速（2h）、 高效地检测福氏志贺氏菌。

主要参考资料

[1] 姜铮, 王芳, 何湘, 等. 志贺氏菌致病机制研究进展[J]. CHINA TROPICAL MEDICINE, 2009, 9(7).

[2] 毕宇涵, 李鑫, 董锐, 等. 46 株福氏志贺氏菌耐药及 PFGE 分子分型分析[J]. 中国公共卫生管理, 2016 (1): 85-87.

[3] 白冰, 胡耀华, 李敏通, 等. 量子点免疫标记法检测福氏志贺氏菌[J]. 中国酿造, 2013 (11): 43-46.