PIEC细胞的应用

背景^[1-3]

PIEC细胞是分离自猪髋动脉内皮组织的上皮细胞样贴壁细胞系，生长培养基RPMI-1640＋10%FBS＋1%P/S，培养条件气相：空气，95%；CO2，5%温度：37℃。

PIEC细胞

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

应用^[4][5]

用于不同形式的蛋氨酸源在猪不同细胞系中的代谢特征和对细胞功能的影响研究

建立了同时检测猪不同细胞中Met代谢产物与辅助因子含量的LC-MS/MS方法;测定了不同形式Met源在猪的多种细胞系中代谢产物的变化及其代谢规律;进一步揭示了在猪肠上皮细胞（intestinal porcine epithelial cell line,IPEC-J2）、髋动脉内皮细胞（pig iliac artery endothelial cell line,PIEC）和滋养层细胞（porcine trophectoderm cell line,pTr2）中不同形式Met源对细胞功能的影响;并从甲基化修饰的角度,探索了不同形式Met源代谢差异及对猪细胞功能和mRNA的m6A修饰水平的影响。

主要研究内容和结果如下:1.同时检测Met代谢产物与辅助因子的LC-MS/MS方法的建立本研究以IPEC-J2和PIEC细胞为材料,建立了能同时检测Met代谢产物与辅助因子的LC-MS/MS方法。通过优化流动相与还原剂,确定以10mmol/L乙酸铵为流动相A,甲醇与乙腈4:1混合溶液为流动相B,TCEP为还原剂。结果表明,各分析物的定量限为0.02-0.91 ng/106个细胞,回收率范围为74.1%-117.4%,准确度为93.5%-123.4%。除MTA与维生素B12（vitamin B12,VB12）以外,其他物质的日内与日间检测值的RSD均小于15%,除Hcy外,各物质的基质效应均小于20%,以上结果表明该检测方法可靠。

2. 不同Met源在猪多种细胞系中的代谢特点利用建立的LC-MS/MS检测方法,检测了分别以L-Met、DL-Met、DL-HMTBA与DL-MM作为Met源时,猪的IPEC-J2细胞、肾脏细胞（pig kidney cell line,PK-15）、PIEC和pTr2细胞系,以及原代肝脏细胞中Met的代谢产物与辅助因子的含量,以揭示其代谢特点。

主要结果如下:（1）以DL-HMTBA和DL-MM作为Met源时,IPEC-J2和pTr2细胞中Met的含量显著低于其它Met源组（P<0.01）;而在猪肝脏细胞、PIEC和PK-15细胞中,各组的Met含量差异不显著。通过应用Transwell模型,并测定下层腔室中Met源的含量发现,大量DL-HMTBA逃逸了IPEC-J2细胞的代谢,以DL-HMTBA的形式转运出IPEC-J2细胞;而部分DL-MM则以二肽与游离Met形式转运出IPEC-J2细胞,致使DL-HMTBA和DL-MM向胞外提供的Met源高于其他Met源组。

（2）对于转甲基代谢而言,以DL-HMTBA为Met源时,5种细胞中MAT2A的mRNA水平显著提高,但其产物SAM在IPEC-J2和pTr2细胞中仍显著低于其它组（P<0.01）;而SAM转甲基代谢后的产物SAH则仅在IPEC-J2中仍较其它Met源低,在其它细胞中均显著高于其他Met源组;除肝脏细胞外,以DL-HMTBA为Met源时,SAM/SAH比值显著低于其它Met源组（P<0.01）。DL-MM对SAM和SAH的影响与DL-HMTBA类似,但影响较小。以上结果表明,DL-HMTBA促进了Met的转甲基代谢,而这种改变可能与代谢酶MAT2A的表达量提高有关。

（3）对于转硫代谢而言,作为转硫代谢的底物,在IPEC-J2细胞中,DL-HMTBA处理组胞内Hcy含量显著低于其他Met源,而在肝脏细胞和PK-15细胞中显著高于其他Met源处理组（P<0.01）,在PIEC细胞中则是无显著性差异。在5种细胞中,DL-HMTBA均提高了胞内转硫代谢产物Cys或/和GSH或/和H2S的含量。该代谢差异可能与DL-HMTBA提高胞内CBS或/和CTH的mRNA水平有关（P<0.01）。表明DL-HMTBA可能通过上调CBS或/和CTH表达,促进了Met的转硫代谢。

参考文献

[1]Differential m 6 A,m 6 A m,and m 1 A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm[J].Jiangbo Wei,Fange Liu,Zhike Lu,Qili Fei,Yuxi Ai,P.Cody He,Hailing Shi,Xiaolong Cui,Rui Su,Arne Klungland,Guifang Jia,Jianjun Chen,Chuan He.Molecular Cell.2018(6)

[2]Decreases in GSH:GSSG Activate Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2（VEGFR2）in Human Aortic Endothelial Cells[J].Priya K.Prasai,Bandana Shrestha,A.Wayne Orr,Christopher B.Pattillo.Redox Biology.2018

[3]Fishmeal levels can be successfully reduced in white shrimp（Litopenaeus vannamei）if supplemented with DL‐Methionine（DL‐Met）or DL‐Methionyl‐DL‐Methionine（Met‐Met）[J].J.‐J.Xie,A.Lemme,J.‐Y.He,P.Yin,C.Figueiredo‐Silva,Y.‐J.Liu,S.‐W.Xie,J.Niu,L.‐X.Tian.Aquaculture Nutrition.2018(3)

[4]Homocysteine and Dementia:An International Consensus Statement[J].A.David Smith,Helga Refsum,Teodoro Bottiglieri,Michael Fenech,Babak Hooshmand,Andrew McCaddon,Joshua W.Miller,Irwin H.Rosenberg,Rima Obeid.Journal of Alzheimer’s Disease.2018(2)

[5]左方瑞.不同形式的蛋氨酸源在猪不同细胞系中的代谢特征和对细胞功能的影响[D].华中农业大学,2020.