PA319 人大肠癌细胞的应用

背景^[1-3]

PA319人大肠癌细胞是来源于人大肠癌的上皮细胞样贴壁细胞系，细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。生长培养基：RPMI-1640＋10%FBS＋1%P/S，培养条件：气相空气95%；CO25%，温度：37℃。

PA319人大肠癌细胞

细胞复苏：

1.将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

2.在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

细胞传代

1.吸走多余培养基，加入3-5mL PBS后轻轻晃动培养瓶润洗细胞；

2.吸干净PBS后加入1mL 0.25%胰酶-0.53mM EDTA，轻轻摇晃培养皿使胰酶浸没细胞表面，培养瓶放37度培养箱消化；

（细胞对于消化比较敏感，消化过度会严重影响细胞状态，导致细胞传代死亡漂浮或者传代后不长。细胞消化到细胞间隙变大但未脱落，可以轻轻吹下时即可终止，禁止消化到细胞完全漂浮。混匀细胞时尽量轻柔，不要吹出大量气泡。）

3.加入6-8ml完全培养基终止消化，轻轻吹下细胞混匀；

4.将混匀的细胞1000rpm（约150g）离心3min，弃上清，再用新鲜培养基重悬37度培养箱继续培养；

细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

1.弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；

2.将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

3.将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

应用^[4][5]

用于MCP-1/CCR2轴活性在大肠癌侵袭转移中的作用及意义研究

从MCP-1/CCR2轴在大肠癌正常黏膜、腺瘤、大肠癌的组织表达,MCP-1在大肠癌患者血清表达情况,激活MCP-1/CCR2轴对大肠癌细胞侵袭力的影响等方面进行初步研究,以明确MCP-1/CCR2轴激活后对大肠癌的影响。

方法:1.组织学及血清学标本收集有完整临床病理资料的大肠癌的术后病理组织标本177例,其中男103例,女74例,平均年龄59.0岁；随机选取66例癌旁5-10cm肠黏膜组织作为正常对照,其中男41例,女25例,平均年龄56.5岁；腺瘤组织65例,其中男39例,女26例,平均年龄57.2岁,所有患者术前均未接受放化疗及其他针对肿瘤的特殊治疗,以全国大肠癌协作组病理组规范进行病理诊断、分级和分期。按分化程度分为：高分化腺癌67例,中分化腺癌56例,低分化腺癌与粘液腺癌共同归为低分化组一并统计共54例。按Dukes分期分为：A期21例,B期66例,C期50例,D期40例。收集大肠癌患者的血清66例,54例健康志愿者的血清做正常对照组。大肠癌组66例,男33例,女33例,平均年龄60.0岁,正常对照组54例,男23例,女31例,平均年龄54.9岁。大肠癌患者均经手术治疗且经手术病理确诊。血清采集前均未经手术、化疗、介入等治疗。

2免疫组织化学染色应用ABC法检测MCP-1,SP法检测CCR2。样本的连续切片（4μm）经二甲苯脱蜡及梯度乙醇逐步水化后,按照不同SP试剂盒和ABC试剂盒说明书要求操作。抗原修复过程中检测MCP-1采用pH9.0Tris-EDTA水浴加热抗原修复,检测CCR2采用pH6.0枸橼酸钠微波抗原修复,一抗MCP-1（1：50,鼠抗人,购自R&D公司）,CCR2（1：400,兔抗人,购自Abeam公司）4℃孵育过夜,均采用DAB显色,镜下掌握显色程度。苏木素复染1min,盐酸酒精分化。脱水、透明、封片、镜检。每次实验均以已知阳性组织切片为阳性对照,以PBS缓冲液代替一抗,做阴性对照。所有结果由一个研究者和一个病理科高级医师独立阅片评分。

3染色评分不加一抗的组织切片作为阴性对照,已知抗原表达的组织切片作为阳性对照。光镜下观察每例免疫组化染色切片,腺体细胞胞浆出现棕黄色阳性颗粒为阳性细胞,随机观察10个高倍视野,每个视野计数100个腺体细胞,根据阳性细胞比率和染色强度综合评定。①阳性细胞比率评分：0分为阳性细胞数占总细胞数<10%,1分为10%-50%,2分为阳性细胞数占总细胞数50%-75%,3分为阳性细胞数占总细胞数>75%。②组织染色强度评分：0分为无染色,1分为淡黄色,2分为黄色,3分为棕褐黄色。③总分=阳性细胞比率评分×染色强度评分：0分为阴性（-）,1～2分为弱阳性（+）,3～4分为中度阳性（++）,5～6分为强阳性（++）。

参考文献

[1]CCL2（pM levels）as a therapeutic agent in inflammatory bowel disease models in mice[J].N.Maharshak,G.Hart,E.Ron,E.Zelman,A.Sagiv,N.Arber,E.Brazowski,R.Margalit,E.Elinav,I.Shachar.Inflamm Bowel Dis.2010(9)

[2]The role of monocyte chemoattractant protein MCP1/CCL2 in neuroinflammatory diseases[J].Grégory Conductier,Nicolas Blondeau,Alice Guyon,Jean-Louis Nahon,Carole Rovère.Journal of Neuroimmunology.2010(1)

[3]Lipid bodies in oxidized LDL-induced foam cells are leukotriene-synthesizing organelles:a MCP-1/CCL2 regulated phenomenon[J].BBA-Molecular and Cell Biology of Lipids.2009(11)

[4]Monocyte Chemotactic Protein 1 Promotes Lung Cancer–Induced Bone Resorptive Lesions In Vivo[J].Zhong Cai,Qiuyan Chen,Jun Chen,Yi Lu,Guozhi Xiao,Zhihao Wu,Qinghua Zhou,Jian Zhang.Neoplasia.2009(3)

[5]马凤丽.MCP-1/CCR2轴活性在大肠癌侵袭转移中的作用及意义[D].南方医科大学,2012.