小鼠第八因子相关抗原(FⅧAG)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠第八因子相关抗原(FⅧAG)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中第八因子相关抗原(FⅧAG)水平。

原理：用纯化的第八因子相关抗原(FⅧAG)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入第八因子相关抗原(FⅧAG)，再与HRP标记的第八因子相关抗原(FⅧAG)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的第八因子相关抗原(FⅧAG)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中第八因子相关抗原(FⅧAG)浓度。

小鼠第八因子相关抗原(FⅧAG)ELISA KIT

操作步骤：

1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9）在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于基于“心主血脉”探讨炙甘草汤治疗贫血模型小鼠的机制研究

通过研究炙甘草汤对贫血模型小鼠的造血因子的影响,以观察补心方剂参与调节造血过程的程度,以更全面地理解“心主血脉”这一中医基础理论的,同时也为再生障碍性贫血、肿瘤等疾病过程中出现的难治性贫血提供更有效的治疗思路。

方法：将150只体重在18-22g的小鼠随机分为五组,统一饮食,除正常组以外,其他四组小鼠隔日放血0.2m1,隔日游泳20mmin。造模第8天开始灌胃,给药组给予相对应的药剂,正常组和对照组给予等量生理盐水,灌胃的同时继续造模至实验结束。分别于给药3天、7天、14天分三个批次随机抽取10只小鼠,摘眼球取血做外周血象分析,然后折颈处死,取股骨用免疫组化方法检测骨髓中CD34、F-ⅧRAg及EPO、SCF水平变化。

结果：1.炙甘草汤对外周血象的影响：三天批次检测小鼠RBC、Hb值与正常对照组值比较降低显著,而WB、PLT无明显的变化。七天批次的血常规中,炙甘草汤组和右归饮组小鼠的RBC和Hb值与模型组的值相比较均显著升高,WBC值未见变化,而合剂组的PLT值升高。十四天批次的三个给药组小鼠的RBC值与模型组RBC值之间无差异,三个给药组的Hb值与模型组Hb值比较有所升高,五组WBC值和PLT值无明显差异。

2. 炙甘草汤对血清及骨髓EPO、SCF的影响：通过对小鼠血清中EPO和骨髓中EPO的检测,仅有三天批次右归饮组中的骨髓EPO值增高,其余批次和分组中均未出现明显的改变。通过对血清SCF的检测,给药组SCF值有明显的升高：而骨髓中的三天批次和七天批次的值无明显增长,十四天批次中的右归饮组SCF值升高明显。

3.炙甘草汤对骨髓中CD34、F-ⅧRAg的影响：三天批次检测中发现经过造模的四组小鼠骨髓中CD34与正常组小鼠的比较均减少,差异显著；而七天批次中模型组小鼠骨髓CD34明显低于正常组小鼠骨髓中CD34,而三个给药组与模型组比较值有所升高；十四天批次小鼠骨髓中CD34的值在五组之间无差异。骨髓中F-ⅧRAg检测中,三天批次炙甘草汤组小鼠F-ⅧRAg明显升高；七天批次中三组给药组的F-ⅧRAg值均有所增高,尤其炙甘草汤组和右归饮组增高明显；十四天批次同七天批次一样,三个给药组值均升高,以炙甘草汤组和右归饮组明显。

参考文献

[1]An isoform of transcription factor CREM expressed during spermatogenesis lacks the phosphorylation domain and represses cAMP-induced transcription.W H Walker,B M Sanborn,J F Habener.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1994

[2]Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse:a model of vessel loss,vessel regrowth and pathological angiogenesis.Kip M Connor,Nathan M Krah,Roberta J Dennison,Christopher M Aderman,Jing Chen,Karen I Guerin,Przemyslaw Sapieha,Andreas Stahl,Keirnan L Willett,Lois E H Smith.Nature Protocols.2009

[3]CREB-binding protein silencing inhibits thrombin-induced endothelial progenitor cells angiogenesis.Hong Jiang,Si-si Chen,Jian Yang.Molecular Biology Reports.2012

[4]Involvement of Oxidative Stress and Caspase-3 in Cortical Infarction after Photothrombotic Ischemia in Mice[J].Gyung W.Kim,Taku Sugawara,Pak H.Chan.Journal of Cerebral Blood Flow&Metabolism.2000(12)

[5]白蓝郦.基于“心主血脉”探讨炙甘草汤治疗贫血模型小鼠的机制[D].成都中医药大学,2013.