干细胞因子(SCF)重组蛋白的应用

背景^[1-3]

干细胞因子(SCF)重组蛋白是应用了重组DNA或重组RNA的技术从而获得的蛋白质。目前,体外重组蛋白的生产主要包括四大系统:原核蛋白表达,哺乳动物细胞蛋白表达,酵母蛋白表达及昆虫细胞蛋白表达。生产的蛋白在活性和应用方法方面均有所不同。根据自身的下游运用选择合适的蛋白表达系统,提高表达成功率。

干细胞因子又称肥大细胞生长因子（MGF），Kit配体（KL）及Steel因子（SLF）。它是由骨髓微环境中的基质细胞产生的一种酸性糖蛋白。其糖基连在肽键的N和O基团上，相对分子质量31 000～36 000，由非共价结合的两个相同亚基组成。等电点PI=3.8。SCF共有273个氨基酸。从-25～-1为信号肽，+1～+189为膜外功能区，+190～+216为跨膜区，+217～+248为胞浆功能区。鼠与人的SCF有83%的同源性。

干细胞因子(SCF)重组蛋白

SCF在小鼠由10号染色体Steel位点编码。在人位于12 q22～24。SCF有2种存在形式：可溶性和膜结合型。

在人，编码248个氨基酸的mRNA（SCF248），其第6个外显子中有一蛋白切割位点。由此mRNA表达165个氨基酸的可溶性SCF。编码220个氨基酸的mRNA（SCF220），其第6个外显子中无蛋白切割位点。由此mRNA表达膜结合型SCF。在鼠，可溶性SCF可由SCF248在第6外显子切割或SCF248和SCF220的第7外显子切割而成。膜结合型SCF由SCF220表达。

2种形式SCF均有生物学活性。鼠和人SCF对人造血细胞几乎有相等的生物学活性，但对鼠细胞，鼠SCF比人SCF生物效应强800倍。

应用^[4][5]

用于干细胞因子SCF通过抑制AKT/mTOR信号通路促进脂肪干细胞的成骨分化研究

间充质干细胞在细胞治疗以及重建医学中具有重要的意义。人脂肪组织来源的干细胞具有较低的供体发病率、良好的可塑性、产量高等特点,使得它在骨重建过程中成为可靠的细胞种子来源。而提高脂肪干细胞的成骨分化能力能使得它更好地治疗骨损伤。

利用干细胞因子处理脂肪干细胞并进行相关的成骨机制方面的研究,探讨了AKT/m TOR信号通路对脂肪干细胞成骨的调控作用。

方法:（1）采用I型胶原酶消化法从脂肪组织中分离得到脂肪干细胞,利用油红-O检测其成脂能力以及利用茜素红染色检测其成骨能力,利用流式细胞术鉴定其表面标记物;

（2）利用干细胞因子处理脂肪干细胞,通过MTT检测不同浓度的干细胞因子对脂肪干细胞的增殖影响作用。通过荧光定量PCR以及茜素红染色、碱性磷酸酶染色检测脂肪干细胞在不同时间段的成骨情况;

（3）荧光定量PCR、茜素红染色、碱性磷酸酶染色以及western blotting实验分析干细胞因子调控脂肪干细胞成骨的机制。

结果:（1）从脂肪组织中提取的脂肪干细胞能够进行贴壁生长、成脂成骨分化,细胞表面阳性表达CD105,CD73和CD90,而不表达CD45,CD34,CD14和HLA-DR;

（2）干细胞因子能够促进脂肪干细胞的增殖。此外,干细胞因子也能促进脂肪干细胞的分化能力,尤其是成骨分化能力,同时能降低脂肪干细胞中干性基因的表达。

（3）干细胞因子促进脂肪干细胞的成骨分化能力的最适浓度为10ng/ml,尤其是在早期能够促进成骨标记物OPN/RUNX2/ALP的表达;

（4）SCF能抑制脂肪干细胞中AKT以及m TOR的磷酸化,而AKT的抑制剂LY294002能促进脂肪干细胞的成骨分化能力。此外,m TOR的抑制剂Rapamycin也能促进脂肪干细胞的成骨分化能力,且能够协同干细胞因子促进脂肪干细胞的成骨分化能力。

结论:干细胞因子能够促进脂肪干细胞的成骨分化能力,其作用效果能够被AKT/m TOR信号轴的抑制剂Rapamycin以及LY294002增强,这表明AKT/m TOR信号通路是调控脂肪干细胞成骨分化能力的关键信号通路,这也为今后的脂肪干细胞在临床上治疗骨损伤提供了新的思路和选择。

参考文献

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[2]Scaffold-free Three-dimensional Graft From Autologous Adipose-derived Stem Cells for Large Bone Defect Reconstruction:Clinical Proof of Concept[J].Denis Dufrane,Pierre-Louis Docquier,Christian Delloye,Hélène A.Poirel,Wivine André,Najima Aouassar.Medicine.2015(50)

[3]TWIST1 Silencing Enhances In Vitro and In Vivo Osteogenic Differentiation of Human Adipose‐Derived Stem Cells by Triggering Activation of BMP‐ERK/FGF Signaling and TAZ Upregulation[J].Natalina Quarto,Kshemendra Senarath-Yapa,Andrea Renda,Michael T.Longaker.Stem Cells.2015(3)

[4]mTOR inhibitors and renal allograft:Yin and Yang[J].Gianluigi Zaza,Simona Granata,Paola Tomei,Valentina Masola,Giovanni Gambaro,Antonio Lupo.Journal of Nephrology.2014(5)

[5]陈海璇.干细胞因子SCF通过抑制AKT/mTOR信号通路促进脂肪干细胞的成骨分化[D].暨南大学,2016.