WI-38细胞专用培养基的应用

背景^[1-3]

WI-38细胞专用培养基可保持WI38/VA13细胞的生长状态。本产品中已包含WI38/VA13细胞生长所需的各种成分，无需添加任何成分，可直接用于WI38/VA13细胞的体外培养。

WI-38细胞是从女性高加索人的正常胚肺组织中获得的一株人2倍体细胞系。它的培增时间为2Rh，有限寿命为Sd代。它是成纤维细胞，能产生胶原。WI-38细胞是首株用于人类疫苗制备的人二倍体细胞系，培养液中添加TNF-α可以促进WI-38细胞生长。

WI-38细胞

培养步骤

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3、轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于D-半乳糖诱导WI-38细胞衰老模型的建立及机制研究

以D-半乳糖诱导WI-38（PDL30-40）细胞衰老,以建立D-半乳糖诱导细胞衰老模型,并在此基础上探讨诱导衰老的分子机制并寻找潜在的抗衰老靶点。

采用MTT法测定不同浓度D-半乳糖（0,1.25,2.5,5,10,20g/L）对WI-38细胞活力的影响;SA-β-Gal染色检测不同浓度D-半乳糖（0,1.25,2.5,5,10 g/L）连续处理WI-38细胞14d后衰老状况;Western Blot法检测细胞周期抑制蛋白P21和P16和衰老标志蛋白β-gal的表达;DCFH-DA法测定不同浓度D-半乳糖对WI-38细胞总ROS水平的影响;Western Blot检测抗氧化酶、自噬标记蛋白和自噬相关通路蛋白表达。

在D-半乳糖诱导细胞衰老模型上,采用不同浓度Mito Q进行干预,DCFH-DA法进一步测定细胞总ROS,SA-β-Gal染色检测衰老状况,Western Blot进一步检测衰老相关蛋白、抗氧化蛋白以及自噬标记蛋白表达,MDC法检测自噬。

结果如下:1、D-半乳糖诱导WI-38细胞衰老模型的建立（1）D-半乳糖对WI-38细胞活力具有一定的抑制作用,并且随着浓度的增高而下降。

（2）D-半乳糖可诱导WI-38细胞衰老;不同浓度D-半乳糖作用14d后,SA-β-Gal染色细胞阳性率随着浓度的增加而增高,在5g/L浓度时达到最高。

（3）不同浓度D-半乳糖处理14d,P21、P16和β-gal表达随着D-半乳糖浓度的增加而逐渐增高,P16和β-gal表达在5g/L浓度达到最高。

2、D-半乳糖诱导WI-38细胞衰老机制研究（1）不同浓度D-半乳糖作用WI-38细胞24h,细胞总ROS随着浓度的增加而增高,并且在5g/L浓度及后续浓度处具有显著差异性。

（2）不同浓度D-半乳糖连续处理WI-38细胞14d后,抗氧化酶SOD2、SOD1和CAT的表达随着D-半乳糖浓度的增高而降低,并且与对照组比较SOD2,SOD1,GPX1和CAT在5g/L浓度处均显著降低。

（3）不同浓度D-半乳糖连续处理WI-38细胞14d后,在5g/L浓度处自噬标记蛋白LC3II水平降低,P62水平增高,同时自噬通路蛋白P-AMPKα（Thr172）,P-ULK1（Ser555）,P-ULK1（Ser757）蛋白水平降低,P-m TOR（Ser2448）和P-m TOR（Ser2481）水平增高,以上这些变化与细胞衰老呈现一定的相关性。

（4）Mito Q可抑制D-半乳糖诱导WI-38细胞产生的ROS。

（5）Mito Q干预后与诱导衰老组比较抗氧化酶SOD2,SOD1,GPX1和CAT表达增高。

（6）Mito Q干预后与诱导衰老组比较自噬水平升高,自噬标记蛋白LC3II水平显著增高,与此同时P62水平显著降低。MDC结果显示诱导衰老组与对照组比较荧光强度显著降低,而Mito Q干预后荧光强度明显增强。

（7）Mito Q干预后可降低衰老程度。连续处理14d SA-β-Gal结果显示,与诱导衰老组比较,Mito Q干预后细胞阳性率显著降低。Western Blot进一步显示Mito Q干预后P21,P16和β-gal表达,与衰老组比较表达均显著降低。

参考文献

[1]Aqueous root extract of Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.Has antioxidant activity in D-galactose-induced aging mice[J].Linghua Lei,Yanhua Chen,Lijun Ou,Yinglong Xu,Xiaoying Yu.BMC Complementary and Alternative Medicine.2017(1)

[2]Rac1/p21‐activated kinase pathway controls retinoblastoma protein phosphorylation and E2F transcription factor activation in B lymphocytes[J].Natalia Zaldua,Francisco Llavero,Alain Artaso,Patricia Gálvez,Hadriano M.Lacerda,Luis A.Parada,JoséL.Zugaza.FEBS J.2016(4)

[3]Risk of dementia and death in the long-term follow-up of the Pittsburgh Cardiovascular Health Study–Cognition Study[J].Lewis H.Kuller,Oscar L.Lopez,James T.Becker,Yuefang Chang,Anne B.Newman.Alzheimer’s&Dementia:The Journal of the Alzhei.2016(2)

[4]The cell biology of aging[J].DiLoreto Race,Murphy Coleen T..Molecular Biology of the Cell.2015(25)

[5]田亚珍.D-半乳糖诱导WI-38细胞衰老模型的建立及机制研究[D].西北师范大学,2018.