半胱氨酸蛋白酶8抗体的应用

背景^[1-3]

半胱氨酸蛋白酶8抗体是一类可以特异性结合半胱氨酸蛋白酶8的多克隆抗体，主要用于半胱氨酸蛋白酶8的体外免疫学检测实验。

半胱氨酸蛋白酶，也称为硫醇蛋白酶，是降解蛋白质的水解酶。这些蛋白酶都有一个共同的催化机制，涉及亲核半胱氨酸巯基的催化三联或对子。

MEROPS蛋白酶分类系统计数14个超家族，加上几个当前未分配的家庭每个包含许多家庭。每个超家族使用催化三联体在不同的或成对蛋白质折叠等代表趋同进化的的催化机制。

半胱氨酸蛋白酶8免疫组化

对于超家族，P表示包含亲核类家族混合物的超家族，C表示纯半胱氨酸蛋白酶。超家族。在每个超家族中，家族由其催化亲核试剂（C表示半胱氨酸蛋白酶）指定。

半胱氨酸蛋白酶催化肽键水解的反应机制的步骤是通过具有碱性侧链的相邻氨基酸（通常是组氨酸残基）使酶活性位点中的硫醇去质子化。下一步是去质子化半胱氨酸的阴离子硫对底物羰基碳的亲核攻击。在这一步中，底物的一个片段被释放出一个胺端，即蛋白酶中的组氨酸残基恢复到其去质子化形式，并形成将底物的新羧基末端连接到半胱氨酸硫醇的硫酯中间体。因此，它们有时也称为硫醇蛋白酶。所述硫酯键随后被水解以产生羧酸剩余的衬底片段上部分，而再生游离酶。

半胱氨酸蛋白酶在生理学和发育的各个方面发挥着多方面的作用。在植物中，它们对生长和发育以及储存蛋白（如种子）的积累和动员很重要。此外，它们还参与信号通路以及对生物和非生物胁迫的响应。在人类和其他动物中，它们负责衰老和细胞凋亡（程序性细胞死亡）、MHCII类免疫反应、激素原处理和对骨骼发育很重要的细胞外基质重塑。

巨噬细胞的能力和其它细胞动员elastolytic半胱氨酸蛋白酶在其表面专门的条件下也可能导致加速的胶原和弹性蛋白的降解在部位炎症在疾病如动脉粥样硬化和肺气肿。几种病毒（如脊髓灰质炎和丙型肝炎）将它们的整个基因组表达为单一的大量多聚蛋白，并使用蛋白酶将其切割成功能单元（例如，烟草蚀刻病毒蛋白酶）。

应用^[4][5]

用于肝素酶在半胱氨酸蛋白酶8抑制下诱导肝癌微血管内皮细胞坏死性凋亡研究

验证肝癌细胞肝素酶（HPSE）诱导微血管内皮细胞坏死性凋亡;并探究肝素酶（HPSE）和半胱氨酸蛋白酶8（caspase-8）在其中的作用及机制。

方法:使用HPSE RNAi慢病毒转染HCCLM3细胞株来敲减HPSE,利用qPCR和Western-Blot实验来验证转染效率。用transwell实验检测肝癌细胞迁移能力。将HCCLM3肝癌细胞与脐静脉内皮细胞HUVEC共培养,利用流式凋亡实验检测内皮细胞死亡率,电镜观察死亡方式。

总共分成四组,非共培养组（HUVEC单纯培养组,Blank组）、HPSE mock组、HPSE RNAi组和NEC-1组,用ELISA实验检测上清液HPSE、TNF-ɑ和caspase-8的含量,用Western-Blot实验检测RIP1、RIP3、MLKL和caspase-8的表达。

通过裸鼠腹腔转移模型的HE染色实验和蛋白荧光双标实验验证肝癌细胞的微血管侵犯。

结果:1、HPSE RNAi慢病毒转染HCCLM3细胞后HPSE基因转录和蛋白表达水平均显著低于mock组（P<0.05）。

2、transwell实验显示降低HPSE表达可抑制肝癌细胞迁移能力（P<0.05 vs mock）。

3、流式凋亡实验结果显示HUVEC细胞与HCCLM3细胞共培养48h后细胞死亡增加（P<0.05）,电镜结果显示共培养死亡细胞有坏死性凋亡特征。

4、ELISA实验结果显示非共培养组和HPSE RNAi组上清液TNF-ɑ和HPSE水平比共培养组降低（P<0.05 co-culture vs Blank、P<0.05 HPSE RNAi vs co-culture）,Western-Blot实验结果显示非共培养组、HPSE RNAi组和NEC-1组RIP1、RIP3、MLKL和caspase-8蛋白的表达比共培养组降低（P<0.05 co-culture vs Blank、P<0.05 HPSE-RNAi vs co-culture、P<0.05 NEC-1 vs co-culture）。

5、裸鼠腹腔转移模型中HE染色未能发现明显的肝脏内微血管侵犯,荧光双标实验结果显示HPSE RNAi组和NEC-1组p-MLKL表达比HCC组降低（P<0.05 HPSE-RNAi vs HCC、P<0.05 NEC-1 vs HCC）。

参考文献

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[4]Heparanase:a rainbow pharmacological target associated to multiple pathologies including rare diseases[J].Silvia Rivara,Ferdinando M Milazzo,Giuseppe Giannini.Future Med.Chem..2016(6)

[5]伍玉海.肝素酶在半胱氨酸蛋白酶8抑制下诱导肝癌微血管内皮细胞坏死性凋亡[D].皖南医学院,2020.DOI:10.27374/d.cnki.gwnyy.2020.000280.