CACO-2 人结直肠腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

CACO-2人结直肠腺癌细胞分离自直肠原位癌；当长到满时，Caco-2细胞表现出特征性的肠上皮细胞分化。Caco-2细胞表达维甲酸结合蛋白I和维甲酸结合蛋白Ⅱ，并呈角质蛋白阳性。生长培养基：MEM＋20%FBS＋1%P/S，培养条件气相：空气，95%；CO2，5%温度：37℃。

CACO-2人结直肠腺癌细胞

操作流程：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中，加入约6ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心5分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。

应用^[4][5]

用于miRNA-214和miRNA-10a在结直肠腺癌中的表达、临床意义及其功能研究

探讨miR-214和miR-10a作为肿瘤标记物对结直肠腺癌的诊断价值，进一步阐明miR-214在结肠肿瘤发生发展过程中的作用机制，为深入了解结直肠腺癌发病及防治机制提供理论依据。

方法：1收集结直肠腺癌患者新鲜组织标本共44例，包括结直肠腺癌肿瘤组织和相应切缘无瘤粘膜组织。

2应用茎环逆转录荧光定量PCR方法检测结直肠腺癌组织和切缘无瘤粘膜组织中miR-214和miR-10a的表达水平，比较两组间表达差异，分析miR-214和miR-10a的表达与结直肠腺癌患者临床病理特征的关系。

3选取9种结肠癌细胞(SW620、SW480、SW1116、HT29、DLD1、LOVO、Caco-2、HCT116p53+/+、HCT116p53-/-)进行细胞培养。

4应用茎环逆转录荧光定量PCR方法检测结肠癌细胞中miR-214和miR-10a的表达水平，比较HCT116p53+/+细胞和HCT116p53-/-细胞中二者的表达差异，分析其与p53基因的关系。

5对HCT116和SW1116两种细胞进行miR-214转染，实验组转染miR-214模拟物，对照组转染阴性对照物，同时设置空白组未做转染处理。

6通过平板克隆形成实验观察细胞转染后HCT116细胞和SW1116细胞克隆形成情况，比较空白组、对照组和转染miR-214组间的差异。

7HCT116细胞和SW1116细胞中进行细胞转染后12h、24h、36h、48h、60h，分别应用MTT比色分析法检测5个时段的OD值，绘制细胞生长曲线，分析空白组、对照组和转染miR-214组间细胞增殖改变情况。

8应用流式细胞技术检测细胞转染后HCT116细胞凋亡情况，比较空白组、对照组和转染miR-214组间的差异。

应用spss13.0软件对数据进行统计分析，数据以中位数（四分位数间距）或均数±标准差表示，两组间配对样本采用Wilcoxon检验或配对t检验，两组间独立样本采用Mann-Whitney检验，重复测量数据采用双因素方差分析，均以P<0.05为差异有统计学意义。

结果：1 miRNA-214和miRNA-10a在结直肠腺癌组织、相应切缘无瘤粘膜中的表达miR-214在44例结直肠腺癌组织和相应切缘无瘤粘膜中的表达水平分别为0.0264（0.0063，0.0591）和0.0505（0.0250，0.1121），结直肠腺癌组织中表达水平明显低于切缘无瘤粘膜组织，差异有统计学意义（Z=-2.591,P=0.0097）；miR-10a在44例结直肠腺癌组织和相应切缘无瘤粘膜中的表达水平分别为0.1108（0.0371，0.3482）和0.1841（0.0962，0.3243），结直肠腺癌组织中表达水平明显低于切缘无瘤粘膜组织，差异有统计学意义（Z=-2.486,P=0.0131）。

2 miR-214和miR-10a的表达与结直肠腺癌临床病理特征的关系miR-214和miR-10a的表达水平均与结直肠腺癌患者的组织学分型密切相关，即非粘液癌中的表达水平显著高于粘液癌（P=0.0138，P=0.0224），而与性别、年龄、部位、浸润深度、分化程度、淋巴结转移和临床分期无关（均P>0.05）。

3 miRNA-214和miRNA-10a在结肠癌细胞中的表达miR-214和miR-10a在结肠癌细胞SW620、SW480、SW1116、HT29、DLD1、LOVO和Caco-2中的表达均明显低于切缘无瘤粘膜组织。

参考文献

[1]MicroRNA-214 downregulation contributes to tumor angiogenesis by inducing secretion of the hepatoma-derived growth factor in human hepatoma[J].Tsung-Chieh Shih,Yin-Jing Tien,Chih-Jen Wen,Ta-Sen Yeh,Ming-Chin Yu,Chia-Hao Huang,Yun-Shien Lee,Tzu-Chen Yen,Sen-Yung Hsieh.Journal of Hepatology.2012(3)

[2]MicroRNA-10a is Overexpressed in Human Pancreatic Cancer and Involved in Its Invasiveness Partially via Suppression of the HOXA1 Gene[J].Kenoki Ohuchida,Kazuhiro Mizumoto,Cui Lin,Hiroshi Yamaguchi,Takao Ohtsuka,Norihiro Sato,Hiroki Toma,Masafumi Nakamura,Eishi Nagai,Makoto Hashizume,Masao Tanaka.Annals of Surgical Oncology.2012(7)

[3]miR-10a overexpression is associated with NPM1 mutations and MDM4 downregulation in intermediate-risk acute myeloid leukemia[J].Experimental Hematology.2011(10)

[4]Circulating microRNA in body fluid:a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis[J].NobuyoshiKosaka,HaruhisaIguchi.Cancer Science.2010(10)

[5]吴晨鹏.miRNA-214和miRNA-10a在结直肠腺癌中的表达、临床意义及其功能研究[D].河北医科大学,2013.