犬Α干扰素(IFN-Α)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

犬Α干扰素(IFN-Α)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法检测样本中犬Α干扰素(IFN-Α)的表达水平。

实验原理：往预先包被α干扰素（IFN-α）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的α干扰素（IFN-α）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

犬Α干扰素(IFN-Α)ELISA试剂盒

样品收集、处理及保存方法

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于重组犬α干扰素活性检测及对犬细小病毒病的疗效研究

重组犬α干扰素生物学活性检测方法，并用不同剂量的重组犬α干扰素对人工复制的犬细小病毒进行药效学研究。

在重组犬α干扰素的生物学活性检测方法的研究中，将MDCK细胞用常规传代方法进行培养，通过细胞浓度优化选择试验，选择每毫升含30～40万个细胞的浓度，在5%CO2培养箱内，37℃静置培养24小时，在培养好的单层细胞上接种不同浓度的重组犬α干扰素，在5%CO2培养箱内，37℃培养24小后用VSV病毒进行攻击，再置37℃5%CO2培养箱内培养，待病毒对照孔75%以上细胞出现病变时，结束攻毒，用结晶紫染色液进行染色，在波长570nm处测定吸光度，通过四参数回归计算法进行数据处理，从而计算出待测样品的活性。

试验判定方法采用结晶紫染色后在570nm波长处测定吸收度值，与常规细胞病变法相比，简单、人为误差小，通过精密度和重现性试验验证，该方法精密度高、重现性好。

为了验证重组犬α干扰素对病毒性疾病的疗效，我们将犬细小病毒接种55～70日龄未接种过犬细小病毒疫苗的毕格犬，待其出现明显的临床症状时用经过上述细胞病变法检测含有高生物学活性的重组犬α干扰素进行治疗。

研究结果表明，配合补液、抗菌、止血、止吐、退热等辅助措施，重组犬α干扰素按40万IU/kg体重对人工复制犬细小病毒病的有效率达100%。通过用不同剂量的重组犬α干扰素对人工复制犬细小病毒病的治疗结果表明，重组犬α干扰素治疗结果与使用剂量呈正相关性，即随着重组犬α干扰素剂量（以细胞效价表示）增加，对犬治愈率增加，死亡率降低。

参考文献

[1] Expression of canine interferon-γby a recombinant vaccinia virus and its antiviral effect[J].Yoshifumi Nishikawa,Akira Iwata,Atsushi Katsumata,Xuenan Xuan,Hideyuki Nagasawa,Ikuo Igarashi,Kozo[2]Fujisaki,Haruki Otsuka,Takeshi Mikami.Virus Research.2001(2)

Genetic polymorphisms in interferon pathway and response to interferon treatment in hepatitis B patients:A pilot study[J].Jennifer K.King,Shiou-Hwei Yeh,Ming-Wei Lin,Chun-Jen Liu,Ming-Yang Lai,Jia-Horng Kao,Ding-Shinn Chen,Pei-Jer Chen.Hepatology.2002(6)

[3]Role of the cytoplasmic domains of the type I interferon receptor subunits in signaling[J].Christine Prejean,Oscar R.Colamonici.Seminars in Cancer Biology.2000(2)

[4]Characterization of the Gene Encoding the 100-kDa Form of Human 2′,5′Oligoadenylate Synthetase[J].Dominique Rebouillat,Alain Hovnanian,Gregory David,Ara G.Hovanessian,Bryan R.G.Williams.Genomics.2000(2)

[5]苏建东.重组犬α干扰素活性检测及对犬细小病毒病的疗效研究[D].中国农业科学院,2013.