逆转录病毒包装的NIH3T3细胞的应用

背景^[1-3]

逆转录病毒包装的NIH3T3细胞是经逆转录病毒包装处理的NIH3T3细胞，NIH3T3细胞是小鼠胚胎成纤维细胞。NIH3T3细胞是1962年Todaro G和Green H从分离的瑞士小鼠胚胎中建立的，该细胞的生长受接触性抑制，汇合状态的单层细胞密度为40000个细胞每平方厘米。

逆转录病毒包装的NIH3T3细胞

逆转录病毒是一种RNA病毒，其基本特征是：在生命过程中，该病毒有一个从RNA到DNA的逆转录过程。逆转录病毒在感染宿主细胞时，会将自身基因组及其携带的外源基因整合入宿主基因组中，因此可以介导外源基因稳定、目的基因的表达。逆转录病毒DNA的整合是病毒RNA复制的必经阶段。只有当受感染的细胞处于细胞分裂期时，逆转录病毒的DNA基因组才能接触到宿主细胞内的遗传物质。因此，逆转录病毒只能在分裂中的细胞中复制。

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

1.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

2.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

3.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于可回复永生化人胎肝细胞系的建立及其移植预防小鼠急性肝衰竭研究

用携带SV40T基因的逆转录病毒表达载体pLNCTIGlox转导原代人胎肝细胞,建立永生化人胎肝细胞系,并对该细胞系的功能特性,永生化细胞的可回复性以及脾内移植预防90%肝切除小鼠肝衰竭的效果进行研究。

方法1.用含新霉素耐药基因（NeoR）、SV40T和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的逆转录病毒表达载体pLNCTIGlox转染包装细胞PT67,获取病毒上清。用NIH3T3细胞滴定病毒滴度,免疫细胞化学染色检测上清感染的NIH3T3细胞中SV40T表达功能。

2. 体外两步灌流法分离孕20周龄人胎肝细胞,常规单层培养原代人胎肝细胞。

3. 用逆转录病毒表达载体pLNCTIGlox病毒上清感染原代培养的人胎肝细胞,用G418选择性培养,筛选成功转导的永生化细胞系。

4. 免疫细胞化学染色检测肝细胞特征蛋白的表达和SV40T蛋白的表达;糖原染色实验检测肝糖原合成情况;细胞计数法测定永生化细胞的增殖特性,绘制生长曲线。

5. 用放射免疫法和自动生化分析仪分别检测永生化细胞的白蛋白和尿素合成。

6. 用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析永生化细胞的肝细胞功能相关基因mRNA的表达。

7. 将4×106永生化细胞移植到严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠左腋下皮下,相同胎肝细胞移植到对侧作为对照,长期观察其是否形成肿瘤。

8.采用90%肝切除术制备急性肝衰竭小鼠模型,小鼠分为4组:G1组经脾移植106永生化细胞,G2组移植106原代胎肝细胞,G3组移植106 HepG2细胞,G4组注射0.1ml DMEM。通过检测血氨和观察细胞移植后小鼠存活情况,评价永生化细胞移植对急性肝衰竭的治疗作用。

参考文献

[1]Generation of murine hepatic lineage cells from induced pluripotent stem cells[J].Hui Gai,David M.Nguyen,Young Joon Moon,Jerell R.Aguila,Louis M.Fink,David C.Ward,Yupo Ma.Differentiation.2010(3)

[2]Telomerase activity and hepatic functions of rat embryonic liver progenitor cell in nanoscaffold-coated model bioreactor[J].Molecular and Cellular Biochemistry.2010(1)

[3]Treatment of Nonalbumin Rats by Transplantation of Immortalized Hepatocytes Using Artificial Human Chromosome[J].M.Ito,M.Ikeno,H.Nagata,T.Yamamoto,A.Hiroguchi,I.J.Fox,S.Miyakawa.Transplantation Proceedings.2009(1)

[4]Life support of artificial liver:development of a bioartificial liver to treat liver failure[J].Naoya Kobayashi.Journal of Hepato-Biliary-Pancreatic Surgery.2009(2)

[5]李俊刚.可回复永生化人胎肝细胞系的建立及其移植预防小鼠急性肝衰竭[D].第三军医大学,2010.