群勃龙的生物学作用

理化性质

群勃龙(Trenbolon，TR)化学名去甲雄三烯醇酮(17．IB-hydroxyestra-4，9，11-trien．3．one-17．acetate)，中文别名：追宝龙，孕三烯酮，与睾酮结构(见图1．2)相比少了一个甲基，多了两组双键。是一种将雄性激素(睾酮或甲基翠酮)经结构修饰后得到的雄性作用减弱，同化作用增强的合成甾体激素。群勃龙主要代谢产物在肝脏内为8-去甲雄三烯醇酮，在肌肉中是小去甲雄三烯醇酮。

群勃龙生物学作用

多数的同化激素借由睾酮的活动而产生效用，如合成代谢(Anabolism)，与男性化(virilization)的效应。同化性效用的例子：促进氨基酸中蛋白质生物合成、促进肌肉变大变壮、促进食欲、促进骨髂的生长、刺激骨髓、促进红血球的产生。促合成作用在增加肌肉围度的效果要比睾酮或大力补更强烈。

群勃龙是一种人工合成的三烯19-去甾甲类化合物，其特性复杂。其抗雌激素和抗孕激素活性可以很强、也可以很弱。作用于丘脑下部．垂体轴以减少促性腺素的释放，排卵前高峰消失，因而抑制排卵。动物实验表明它能抑制孕激素分泌，也具有黄体酮对子宫内膜的作用，使子宫内膜及异位病灶细胞失活、退化，从而导致异位病灶萎缩。其抗生育作用可能是抑制排卵及抑制子宫内膜发育，改变宫颈粘液性质，影响卵子运行速度及拮抗内膜孕酮受体，从而干扰孕卵着床。临床用于治疗子宫内膜异位症，使之萎缩并吸收。由于其具有很强的促蛋白合成作用，随着畜牧业规模化、集约化发展，少数生产企业及饲养者、经营者为谋取利润，置国家法律法规于不顾，滥用或非法使用激素等违禁药品。作为同化激素类添加剂的群勃龙饲养家畜，常常造成群勃龙在动物源性食品中残留超标。当人们食用了残留超标的动物性食品后，会在人体内蓄积，产生多种不良后果，直接危害人的健康及生命。

群勃龙与疾病的关系

群勃龙的使用可加速孩童骨骼的老化、男性乳房发育，甚至可能会造成骨骼停止生长。许多合成的同化性类固醇被设计为能够制造出更多的雄性激素，而非产生雌性化反应。其副作用包括高血压、胆固醇上升、皮肤痤疮、性功能减退以及睾丸萎缩。男性使用者有可能会丰胸。女性使用者则是体毛增长、声音变低沈、胸部变小、阴蒂涨大以及经期不规律。部分副作用是无可避免的。长期使用者，还可造成肝功能严重受损。

由于群勃龙具有雄激素作用，女性长期应用可引起水钠潴留及女性轻微男性化现象。有时引起肝内毛细胆管胆汁郁积而发生黄疸。肾炎、心力衰竭和肝功能不良者慎用，孕妇及前列腺癌病人禁用。

具有很强的促蛋白合成作用的群勃龙，常被作为动物生长促剂用于动物养殖，群勃龙在动物的细胞、组织或器官中蓄积以原形或中间代谢产物(β-去甲雄三烯醇酮、α-去甲雄三烯醇酮)形式存在。

群勃龙残留的危害包括对动物本身产生的危害和由于群勃龙在动物源食品中的残留对人体产生的危害。群勃龙作为动物生长促剂，会在食用动物的肝、肾和肌肉等有残留存在。群勃龙残留，指的是在动物养殖过程中使用群勃龙，群勃龙以原形或中间代谢产物在动物的细胞、组织或器官中蓄积的现象。一旦被人食用后，可产生一系列激素样作用，如破坏人机体的激素平衡、干扰人的内分泌功能、影响生育能力、并具有潜在致癌性、发育毒性(儿童早熟)及女性男性化，大剂量时可致肝功能障碍。欧盟从1998年就禁止生长激素用于食品动物的饲养，2004年欧盟对我国畜禽产品提出了18个种类的兽药残留、抗生素检测监控要求，其中明确指出，动物源性食品药物残留中，群勃龙不得检出。我国农业部2002年4月发布的第193号公告《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》也明确表示，性激素类原料药及其单方、复方制剂产品不准以抗应激、提高饲料报酬、促进动物生长为目的在所有食品动物的饲养过程中使用。国际食品法典委员会(CAC)、美国、日本等组织和国家对动物食品中蛋白同化类激素的残留都有严格的要求。我国农业部于2002年发布的第235号文件中规定丙酸睾酮、苯丙酸诺龙、甲睾酮、群勃龙等在动物性食品中的最高残留限量为不得在动物性食品中检出。

群勃龙检测现状

激素残留检测样品基质复杂、干扰物质多、浓度极低(水平为1 Pg／kg-1mg／kg)，动物源性食品激素残留检测要求准确定性或精确定量，对方法的灵敏度、准确度、特异性等要求极高。目前检测方法大致可分为两类：色谱／质谱分析和免疫学方法。动物组织中蛋白同化激素类药物色谱／质谱分析主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱．质谱法(GCoMS)和液相色谱．质谱法(GC-MS)和液相色谱-质谱法（LC-MS）液相色谱一串联质谱(LC-MS-MS)。免疫学方法主要是利用抗原抗体特异性结合的原理，标记不同的标记物可建立相应的的免疫分析方法，常见的有酶联免疫吸附测定(Enzyme linked imunosorbent assay，ELISA)、放射免疫测定(Radio imunoassay，RIA)、化学发光免疫测定(Chemiluminescent immnoassay，CLEIA)、荧光免疫分析技术(F队)及毛细管电泳检测技术等。

1、色谱／质谱分析

(1)高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法工作原理与气相色谱工作原理基本一致，它是以液体作为流动相，采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。而气相色谱是以气体为流动相。根据固定相性质高液相色谱可分为吸附色谱、键合色谱、离子交换色谱及大小排阻色谱。高效液相色谱不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因此对样品的适用性很广。

(2)气相色谱-质谱联用法(CC-MS)

气相色谱．质谱联用是国际反兴奋剂中心主要采用检测蛋白同化激裂，原理流程是，当一个混合物样品注入气相色谱仪的进样口后，在色谱柱中进行分离，每种组份以不同的保留时间离开色谱柱出口。经分子分离器除去载气，只让组份分子进入离子源。经电离后，分子离子和碎片离子被聚焦成离子束送入滤质器。选择滤质器的电场参数，即可使不同质荷比的离子顺序穿过滤质器，为二次电子倍增器接收、放大，形成质谱，即横坐标为质荷比(m，e)，纵坐标为离子流强度的图形，可对该化合物定性。另外在色谱柱流出化合物期间，将重复扫描的每一张质谱中各个m／e的离子相加，可构成总离子流色谱图，从而对化合物进行定量分析。整个工作过程由计算机控制着仪器的调整、运行、数据采集和处理，测试过程在真空条件下进行。适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物。

气相色谱．质谱联用法在群勃龙检测方面的研究上世纪八、九十年代便以应用较多，Shih．Hsien Hsu等于1988年用于检测牛组织中的TR，在牛肉和内脏中TR检出限为0．5ppb。CaSadmont等对小牛尿液通过逆向分离管柱萃取和过柱提纯，用GC-MS检测，TR检出限达0.5ng／mg。国内亦有相关报道。

(4)液相色谱一串联质谱(LC-MS-MS)

LC-MS是一种重要的现代分离分析技术，它应用范围极广的分离方法与灵敏专属、能提供相对分子质量和结构信息的质谱法结合起来，但不足之处在于基质对待测组分的干扰难以排除及待测组分的结构信息不能充分利用。而液相色谱与串联质谱联用(LC-MS-MS)在一级质谱MS条件下获得很强的待测组分的准分子离子峰，几乎不产生碎片离子，并可对准分子离子进行多级裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，从而推断化合物结构，确认目标化合物，辨认重叠色谱峰以及在高背景或干扰物存在的情况下对目标化合物定量，因而成为药物代谢过程和产物研究，复杂组分中某一组分的鉴定和定量测定，以及药用植物成分研究中更为强有力的工具。刘清等通过选择离子，得到清晰的群勃龙、勃地酮的色谱图，群勃龙的检出限为O．31ug／kg。Mara Gasparinit等采用亲和免疫技术提取尿液群勃龙代谢物，通过LC-MS-MS检测检出限在0．54～0．60ug/L之间。F Buiarellia等用LC—MS-MS测定牛尿液和血清中TR，检测限(1imit ofdetection，LOD)和定量限(1imit of quantification，LOQ)分别为350 pg／ml和lng／ml。

2、免疫学方法

免疫学方法有主要是利用抗原抗体特异性结合的原理，标记不同的标记物可建立相应的的免疫分析方法，常见的有酶联免疫吸附测定(Enzyme linked imunosorbent assay，ELISA)、放射免疫测定(Radio imunoassay，Rta)、化学发光免疫测定(Chemiluminescent immnoassay，CLEIA)、荧光免疫分析技术(CLEIA)等。而RIA由于使用的标记物具有放射性，易造成污染，近年有被其他免疫标记方法所取代的趋势。目前用于TR检测的免疫学方法国外有ELISA(德国)，CLEIA、CLEIA、胶体金检测TR尚未见报道。

酶联免疫吸附测定(Enzyme linked imunosorbent assay，ELISA)是利用酶的高催化效率放大了免疫反应的结果，使测定具有极高的灵敏度。其基本原理是将已知的抗体或抗原结合于固相载体，加入待检抗原或抗体后，再加入标记的抗体或抗原或第二抗体，通过显色剂显色，依据反应产物的颜色可以进行定性或定量检测。包被物、酶标记物均保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法除去抗原抗体复合物、游离成分，然后加入酶的作用底物催化显色，依据显色情况进行定性或定量测定。

世界粮农组织(FAO)向许多国家推荐此技术，美国化学会亦将ELISA列为农药残余分析的支柱技术之一。国内在这个方面的研究工作开展得相对较晚，但也取得了一些进展。利用这种方法可使残留分析包括前处理步骤大大简化。与色谱／质谱发相比，ELISA法除了具有特异性强、灵敏度高、操作简便、仪器化程度和分析成本低、样品前处理简单、检测时问短、样品容量大等优点外，亦不存在HPLC或GC对待测物蒸气压、热稳定性、卤素、发色团等理化性质的限制，适用于现场监控、大规模样本、基层的快速筛查，是目前最理想的残留筛选性分析方法之一。

对动物源产品生产过程进行监控和执法势在必行，一是制定最高残留限量的强制性标准，二是改进残留分析方法和技术，发展快速、准确和灵敏度高的质量检测手段。本研究的主要内容是制备TR-BSA偶联物，赋予TR免疫原性，为群勃龙单克隆抗体的制备和建立食品中群勃龙残留量的快速检测方法奠定了基础。建立方便于基层检验检疫部门应用的快速、灵敏的TR检测方法，以从源头上监测、控制此类物质的扩散。

主要参考文献

[1] 周成林2010- 江苏大学:临床检验诊断学