5-羧基荧光素的应用

背景及概述

5-羧基荧光素是一种化学物质，分子式是C21H12O7。

应用 ^[1]

5-羧基荧光素用于制备一种真菌荧光染色液：随着医疗检验水平的不断推进，近年来真菌荧光染色临床检验技术逐渐推广，目前市场上大多采用细胞壁β-多糖、几丁质等荧光染色法，该方法只通过荧光染料与细胞壁 β-多糖、几丁质等以亲和力结合，不具有特异性；随着临床逐渐推广发现，易受到染色底物杂质的干扰，影响观察结果的判断；另外，荧光衰退较快，样本无法保存；这给临床推广及应用造成非常大的困扰。

针对医学临床检验中病原菌生物学检验，为能够快速准确的检验致病真菌，CN201710899393.8提供一种真菌荧光染色液以5-羧基荧光素与真菌引物ITS4结合形成荧光引物，与真菌核糖体核糖核酸基因间隔(ITS)区碱基发生特异性的结合将真菌标记荧光，用荧光显微镜 在480nm波长下镜检观察背景为黑色，真菌发射出520nm波长的绿色荧光。CN201710899393.8提供一种真菌荧光染色液，由以下重量份(％)的原料组成：

制备方法包括以下步骤：

1)用电子天平准确称取5-羧基荧光素、真菌引物ITS4、水于500ml三角烧瓶中，用 玻璃棒轻轻搅拌充分溶解后，再称取氢氧化钾倒入烧瓶中，轻轻搅拌充分溶解后盖上塞子；

2)将上述溶液放置于37℃恒温摇床，缓慢振摇1小时取出，此为溶液1；

3)用电子天平准确称取甘油、双磷脂酰甘油、抗坏血酸、水于1L三角烧瓶中，用玻 璃棒搅拌充分溶解，此为溶液2；

4)将溶液1缓慢倒入溶液2中，边倒入边搅拌使其充分混合后，即得本发明真菌荧 光染色液，置于棕色瓶中保存。

本发明是这样实现的，通过将上述原料按重量份配制成荧光染色液，荧光染色液 中5-羧基荧光素的羧基与真菌核糖体核糖核酸间隔区引物4(ITS4)的核苷酸链两端的磷酸 基团端氨基残基共价结合标记成荧光引物，在游离状态时该荧光引物形成茎环结构避免5- 羧基荧光素衰退，在氢氧化钾溶液中快速进入真菌细胞与真菌核糖体核糖核酸基因间隔区 (ITS)碱基发生特异性的结合，此时，茎环结构打开，露出5-羧基荧光素将真菌细胞标记荧 光，另外，甘油、双磷脂酰甘油、抗坏血酸形成的抗荧光衰退保护层将露出5-羧基荧光素封 闭式包裹阻止荧光衰退，使真菌样本能长期保存，用荧光显微镜在480nm波长下镜检观察背 景为黑色，真菌发射出520nm波长的绿色荧光。与现有技术相比，

本发明的有益效果是：本发明通过加入5-羧基荧光素和真菌引物ITS4，在游离的状态下真菌引物ITS4形 成茎环结构可有效避免荧光衰退，在氢氧化钾溶液中5-羧基荧光素可穿透真菌细胞壁及细 胞膜与真菌核糖体核糖核酸(rRNA)基因间隔(ITS)区碱基发生特异性的结合，此时茎环结 构打开在荧光显微镜下镜检呈现荧光；氢氧化钾在染色过程中熔化真菌角质层使真菌引物 ITS4快速进入真菌细胞内作用；另外，由于配方中加入了抗荧光衰退剂(甘油、双磷脂酰甘油、抗坏血酸)，使荧光引物与真菌核糖体核糖核酸(rRNA)基因间隔(ITS)区碱基特异性结 合后能长期保持，同时也增加了目标真菌在镜检时发出的荧光强度，使目标真菌标本与背 景之间的对比度大大增强，在镜检过程中使目标真菌更加显目。

因此，本发明的优点在于使用操作简便、观察清晰度高、特异性好、结果准确，有较好的临床应用前景；在临床检验过程 中操作简便、效率高、使用范围全面、特异性好、准确度高；检验灵敏度高，减少检验结果假阴性的发生，进而降低漏检率；视野清晰，反应为荧光反应，在检验视野中以清晰的荧光呈现，便于观察查找，大大提高工作效率；抗干扰能 力强，反应为特异性结合，杂质和非真菌细胞不会被荧光标记，消除了杂质和非真菌细胞对 检验过程中的干扰，使目标更加显目易观察；荧光保持时间长，加入了抗荧光衰减剂形成保护层对5-羧基荧光素进行封闭式包裹，使荧光染料不与外界接触，从而很好的保护了荧光 染料，使荧光持久不衰减，使标本可以保存至相关规定保存期限。图1为实施例1制得的真菌荧光染色液染色结果图。

主要参考资料

[1] CN201710899393.8 一种真菌荧光染色液及其制备方法