吖啶橙荧光染色试剂盒的应用

背景^[1-3]

吖啶橙荧光染色试剂盒(Acridine Orange Detection Kit)主要由AO Stain、AO Stain Buffer组成,常用于细胞凋亡的检测。染色后在荧光显微镜下观察,吖啶橙可透过正常细胞膜,使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光;而在凋亡细胞中,因染色质固缩或断裂为大小不等的片断,形成凋亡小体。

吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒;而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙染色常与EB染色合用双染,EB只染死细胞使之产生桔黄色荧光,由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。

吖啶橙荧光染色试剂盒

吖啶橙(Acridine Orange,AO)属于三环杂芳香燃料,可以标记DNA、RNA,属于异染性荧光染料。该染料具有膜通透性,能透过细胞膜,使核DNA和RNA染色。因此AO常用于细胞内DNA和RNA进行检测。

AO与核酸结合方式主要有:1、插入性结合,AO嵌入核酸双链的碱基对之间,这种结合方式主要为AO与DNA的结合,其荧光发射峰为530nm,激发后呈绿色荧光;

2、静电吸引,带正电荷的AO与单链核酸的磷酸根(带负电荷)产生静电间的吸引结合,这种结合方式主要为AO与RNA的结合,其荧光发射峰为640nm,激发后呈红色荧光,少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。因此,吖啶橙嵌合到双链DNA分子中显绿色,与DNA单链或RNA结合时发桔黄色或橙红色荧光。

应用^[4][5]

用于吖啶橙荧光染色法检测肾癌循环肿瘤细胞及其临床意义研究

应用吖啶橙荧光染色法（acridine orange fluorescent,AO-F）搭建循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）筛选平台,并将其应用于肾癌患者外周血CTCs筛查,评估其在肾癌患者中的临床价值。

方法1、培养肾癌组织原代细胞和肿瘤细胞株769-P,AO-F法染色后加盖片于荧光显微镜下观察细胞形态及着色情况。分别制备死亡肿瘤细胞（75℃水浴30min）和活肿瘤细胞（加新鲜PBS放置30min）。AO-F染色后分别计数5个随机视野下两组细胞中AO-F+细胞所占的比例,评估AO-F染料对肿瘤细胞的敏感性。

2、抽取健康体检者肘正中静脉血5 ml,红细胞裂解液法富集单个核细胞,PBS逐级稀释,配制为含106个单个核细胞的细胞悬液于玻璃管中,共20管。将不同数量的769-P细胞（500、200、100、50、10个/管）与106个单个核细胞混合以模拟肾癌患者外周血CTCs模型,AO-F染色后计算各组肿瘤细胞回收率,验证该方法敏感性和可重复性。

3、使用上述方法检测139例肾癌患者（112例早期患者和27例转移患者）、10例良性肾病患者外周血中CTCs的表达水平。并分析10例健康志愿者的外周血样,评估此方法的特异性。

4、分析CTCs表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、T分类、furhman分级、是否转移等临床病理参数之间的关系。

参考文献

[1]Circulating tumor cells in prostate cancer:A potential surrogate marker of survival.Jérme Doyen,Catherine Alix-Panabières,Paul Hofman,Scott K.Parks,Emmanuel Chamorey,HervéNaman,Jean-Michel Hannoun-Lévi.Critical Reviews in Oncology/Hematology.2012

[2]Detection of circulating tumor cells and its clinical value for different stages and various subtypes of breast cancer.Li L,Liu Y,Zhang S,et al.Chinese Medical Journal.2014

[3]Long term survival following the detection of circulating tumour cells in head and neck squamous cell carcinoma.Stuart C Winter,Sally-Anne Stephenson,Selva K Subramaniam,Vinidh Paleri,Kien Ha,Conor Marnane,Suren Krishnan,Guy Rees.BMC Cancer.2009

[4]Acridine orange flow cytometric analysis of renal cell carcinoma.Clinicopathologic implications of RNA content.El-Naggar A K,Batsakis J G,Teague K,et al.American Journal of Pathology.1990

[5]刘敏.吖啶橙荧光染色法检测肾癌循环肿瘤细胞及其临床意义[D].天津医科大学,2015.