人谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)ELISA 试剂盒的应用

背景^[1-3]

人谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)ELISA试剂盒用于测定人血清、血浆或其它相关生物液体中谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）含量。

实验原理:用纯化的GSH-Px抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的GSH-Px抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的GSH-Px呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（值），计算样品浓度。

谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)

使用方法：

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育2小时。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，每个孔中加入Detection Ab工作液100μl(在使用前15分钟内配制)，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

3.弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μl/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4.每孔加HRP Conjugate工作液(临用前15分钟内配制)100μl，加上覆膜，37℃温育1小时。

5.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。

6.每孔加底物溶液100μl，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右(根据实际显况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止)。

7.每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。

8.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。

应用^[4][5]

用于单纯胰岛素抵抗及糖尿病大鼠脑认知功能障碍相关因素水平的观察研究

用高脂饮食诱导大鼠产生胰岛素抵抗,再复加小剂量STZ,造成2型糖尿病。继而观察单纯胰岛素抵抗和2型糖尿病状态下,脑组织中氧化应激水平、Aβ含量、脂肪酸含量等引起认知功能损伤的因素变化,为探讨2型糖尿病患者发生阿尔茨海默病认知功能障碍的可能分子机理提供实验依据。

方法:1动物分组及取材根据本试验室王晓凌等的造模方法,以成年雄性SD大鼠（体重220-240g）为实验对象,用高脂饮食（脂类以猪油为主,热量比占59.8%）复制胰岛素抵抗模型;在胰岛素抵抗的基础上,一次性注射小剂量STZ复制2型糖尿病大鼠模型。大鼠血清,用于血糖、血胆固醇测定;大脑组织,用于Aβ、MDA、脂肪酸含量、抗氧酶活性的测定,以及总RNA的提取。

2血糖、血胆固醇的测定采用葡萄糖氧化酶法,胆固醇氧化酶法,用HITACHI 7170A型全自动生化分析仪测定血糖、血胆固醇。3脑组织氧化应激指标的测定采用南京建成试剂盒测定脂质过氧化产物丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、过氧化氢酶（CAT）。

参考文献

[1]Free radical-mediated damage to brain in Alzheimer’s disease and its transgenic mouse models[J].Joshua A.Sonnen,John C.Breitner,Mark A.Lovell,William R.Markesbery,Joseph F.Quinn,Thomas J.Montine.Free Radical Biology and Medicine.2008(3)

[2]Cognitive Dysfunction and Diabetes Mellitus[J].Christopher T.Kodl,Elizabeth R.Seaquist.Endocrine Reviews.2008(4)

[3]Oxidative stress induced by beta-amyloid peptide 1–42 is involved in the altered composition of cellular membrane lipids and the decreased expression of nicotinic receptors in human SH-SY5Y neuroblastoma cells[J].Xiao-Lan Qi,Jin Xiu,Ke-Ren Shan,Yan Xiao,Ran Gu,Ru-Yu Liu,Zhi-Zhong Guan.Neurochemistry International.2005(8)

[4]Oxidative stress potentiates BACE1 gene expression and Aβgeneration[J].Y.Tong,W.Zhou,V.Fung,M.A.Christensen,H.Qing,X.Sun,W.Song.Journal of Neural Transmission.2005(3)

[5]陈磊.单纯胰岛素抵抗及糖尿病大鼠脑认知功能障碍相关因素水平的观察[D].河北医科大学,2009.