绿脓菌素测定用培养基的应用

背景^[1-3]

绿脓菌素测定用培养基用于绿脓杆菌的绿脓菌素测定试验。

成分(g/L)：蛋白胨20.0；氯化镁1.4；硫酸钾10.0；琼脂18.0；pH值7.4±0.1 25℃

用法：称取本品49.4g，另称取10g甘油，溶解于1000ml蒸馏水中，分装，121℃高压灭菌15分钟，备用。

绿脓菌素测定用培养基

绿脓菌素生成试验方法及原理：

方法：挑取可疑菌落接种在在绿脓菌素测定用培养基（PDP）斜面上，培养24小时，观察斜面有无色素。如有色素，在试管内加氯仿3.0～5.0mL，充分震摇，使培养物中的绿脓菌素提取在氯仿中，待氯仿提取液呈现绿色时，加1mol/L盐酸约1mL，震摇后静置片刻，上层盐酸溶液中呈现粉红至红色实验结果为阳性，否则为阴性。

原理：铜绿假单胞菌能产生的绿脓菌素能被氯仿提取，且在水中溶解度比氯仿大，并且会发生可逆的氧化还原反应，氧化时碱性呈蓝色，酸性呈红色。所以加入盐酸溶液并震摇后，绿脓菌素会由氯仿转移至盐酸溶液中，并在酸性环境中呈红色。

操作步骤：

1按国家标准、SN标准、FDA标准或其它方法制备样品液

2取样品液1ml加入冷却至45-50℃显色培养基中混匀或涂布于平板上

3 36±1℃培养18～24h，选用有30～200个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠杆菌菌落。大肠杆菌典型菌落为蓝绿色，其它细菌为无色或黄色菌落。总大肠杆菌=蓝绿色菌落

4对可疑大肠杆菌菌落可划线接种到营养琼脂平板上，36±1℃培养12-16小时，挑取单菌落做大肠杆菌全套生化试验

应用^[4][5]

用于环丙沙星体外诱导对铜绿假单胞菌QS基因调控影响的研究

环丙沙星体外诱导对铜绿假单胞菌耐药性的影响

方法:1.实验菌株的选择:将前期收集铜绿假单胞菌非重复性菌株40株经VITEK-2重新鉴定,通过测定菌株对环丙沙星的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentrations,MICs）,筛选出对环丙沙星敏感的菌株,最后选择其中来源于无菌体液和伤口分泌物的菌株与PAO1一起组成本研究的实验菌株。

2. 环丙沙星体外诱导实验:根据各实验菌株对环丙沙星的MICs值,将各菌株分别接种于相应的0.5×MIC,1×MIC,2×MIC和4×MIC四个浓度的含环丙沙星琼脂培养皿中,共传代培养5天,其中诱导1天时的菌株定义为1代菌,诱导2天则定义为2代菌,依次类推。分别保存其中1、3、5代菌株备用。

3. 耐药性的测定及统计分析:采用琼脂倍比稀释法测定所有保存的菌株对环丙沙星的MICs,统计不同诱导浓度及不同时间的耐药率变化。MICs经lg转化后采用重复测量方差分析的方法研究不同浓度的环丙沙星诱导5代对铜绿假单胞菌MICs的影响。P<0.05则差异有统计学意义。

结果:1.实验菌株的选择:课题组前期收集的40株非重复性铜绿假单胞菌的标本类型主要以痰标本26株（65%）为主,其次还有伤口分泌物5株（12.5%）、尿3株（7.5%）和血2株（5%）等。标本来源于临床各住院科室,其中分离到最多的是ICU 7株（17.5%）和呼吸科7株（17.5%）,其次还有血液科6株（15%）、神经科5株（12.5%）和骨科5株（12.5%）等。40株菌中有31株对环丙沙星敏感（77.5%）,其中来源于无菌体液和伤口分泌物中的菌株共11株,与PAO1共同构成实验菌株12株。

2.环丙沙星体外诱导实验:12株菌经0.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC四个浓度共诱导5代,其中分别有2株菌在4×MIC浓度、有1株菌在2×MIC浓度连续培养48小时未有生长而弃去,因此共弃去9株菌,诱导成功并保存135株。

参考文献

[1]Inhibition of quorum sensing related virulence factors of Pseudomonas aeruginosa by pyridoxal lactohydrazone[J].Azam Heidari,Nader Noshiranzadeh,Fakhri Haghi,Rahman Bikas.Microbial Pathogenesis.2017

[2]Pseudomonas aeruginosa quorum sensing modulates immune responses:An updated review article[J].Ashraf Kariminik,Majid Baseri-Salehi,Babak Kheirkhah.Immunology Letters.2017

[3]Anti-quorum Sensing and Anti-biofilm Activity of Delftia tsuruhatensis Extract by Attenuating the Quorum Sensing-Controlled Virulence Factor Production in Pseudomonas aeruginosa.[J].Singh Vijay K,Mishra Avinash,Jha Bhavanath.Frontiers in cellular and infection microbiology.2017

[4]Inhibition of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing by subinhibitory concentrations of curcumin with gentamicin and azithromycin[J].Shahin Bahari,Habib Zeighami,Hesam Mirshahabi,Shekoufeh Roudashti,Fakhri Haghi.Journal of Global Antimicrobial Resistance.2017

[5]高雅婷.环丙沙星体外诱导对铜绿假单胞菌QS基因调控影响的研究[D].山西医科大学,2018.