小鼠冠状动脉平滑肌细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠冠状动脉平滑肌细胞分离自冠状动脉组织采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来。

冠状动脉是供给心脏血液的动脉，起于主动脉根部，分左右两支，行于心脏表面。采用Schlesinger等的分类原则，将冠状动脉的分布分为三型：右优势型、均衡型、左优势型。左右冠状动脉是升主动脉的对分支。

小鼠冠状动脉平滑肌细胞

左冠状动脉为一短干，发自左主动脉窦，经肺动脉起始部和左心耳之间，沿冠状沟向左前方行后，立即分为前室间支和旋支。前室间支沿前室间沟下行，旋支绕过心尖切迹至心的膈面与右冠状动脉的后室间支相吻合。

它是构成冠状动脉壁的主要细胞成分，细胞膜上分布着多种离子通道，如电压依赖性Na+通道、多种Ca2+通道和K+通道；它们参与了静息电位的维持与细胞膜电位的复极化、超极化，调节血管平滑肌的收缩及舒张功能，此外动脉粥样硬化的发展也涉及冠状动脉平滑肌细胞增殖、炎症及凋亡等。

因此，原代分离培养的冠状动脉平滑肌细胞，对研究生理和病理状态下离子通道及血管张力变化机制具有非常重要的作用。

冠状动脉平滑肌细胞原代分离培养3天后，可见细胞贴壁伸展，细胞形态大小不一，呈梭形、不规则形、三角形或扇形，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏；细胞密度低时，常交织成网状；密度高时，则排列为旋涡状或栅栏状。传代后细胞生长较快，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点。

应用^[4][5]

用于心脏血管发育及畸形纠正的基础性研究

研究发现Wdpcp基因对于冠状动脉的发育亦不可或缺。通过SM22α示踪冠脉平滑肌细胞,发现Wdpcp纯合突变小鼠的冠状动脉分支减少,平滑肌细胞数量明显下降,而冠状静脉的发育基本不受影响。

PECAM免疫组化染色显示Wdpcp基因缺失并不影响冠脉血管丛的形成,相比野生型小鼠血管丛的形成速度反而加快。采用Wt1CreERT2-Rosa26mTmG系统示踪心外膜细胞,结果显示Wdpcp纯合突变小鼠胚胎的心外膜来源细胞（EPDCs）相比野生型小鼠显著减少,qPCR分析显示Snail2,Twist1等EMT调节基因和Vinculin,Vimentin等间充质干细胞标志基因表达明显降低。

3D胶原凝胶实验证明Wdpcp纯合突变小鼠的EPDCs其迁移能力相比野生型小鼠明显下降。进一步在小鼠中特异性敲除心外膜细胞的Wdpcp基因,其冠脉缺陷表型与Wdpcp纯合突变小鼠相似。

以上结果证明Wdpcp通过促进心外膜细胞的上皮-间充质转化（EMT）和迁移过程在冠脉血管丛的重塑阶段发挥作用。

研究首次呈现了一个在冠脉血管丛重塑而非形成过程中发生缺陷的小鼠模型,将为冠脉血管丛重塑过程中的分子机制研究提供帮助。22q11.2微缺失综合征（22q11.2DS）是临床上最常见的染色体微缺失综合征,常见临床症状有心血管畸形、头面部畸形、胸腺/甲状旁腺发育不良等,其中心血管畸形主要表现为法氏四联征、法氏四联征合并肺动脉闭锁,另外的类型有主动脉弓离断、右室双出口和永存动脉干等。

其致病基因主要是由于T盒转录基因TBX1的单倍体不足。在合作者Baldini教授实验室在前期实验中发现Tbx1可通过招募甲基化转移酶增强组蛋白3赖氨酸4的单甲基化（H3K4me1）从而调控基因转录。

在此工作基础上,以Tbx1LacZ/+、Tbx1Neo2/LacZ突变小鼠为研究对象,检测组蛋白去甲基化酶抑制剂TCP能否纠正Tbx 1缺失造成的心血管畸形。腹腔注射TCP,收取胚胎10.5天Tbx1LacZ/+突变小鼠,通过墨汁注射观察第Ⅳ咽弓动脉形态,发现其缺陷比例下降;收取胚胎18.5天Tbx1Neo2/LacZ突变小鼠,观察心脏流出道形态,发现TCP可部分纠正永存动脉干畸形,但并不能纠正胸腺缺失的表型。

qRT-PCR分析显示Tbx1的表达量在TCP处理组和PBS对照组无显著差别,说明TCP并非通过上调Tbx1基因本身的表达量起作用。

原位杂交实验证明TCP处理后第二心域细胞（SHF）Fgf8的表达增加,与该结果一致的是,增殖相关基因Cyclin D2在SHF细胞表达增加,增殖相关蛋白PHH3磷酸化水平提高。且TCP处理后SHF极性缺失程度减轻,αPKCζ荧光信号重新趋向细胞顶端分布。

参考文献

[1]Coronary Artery Development:Progenitor Cells and Differentiation Pathways[J].Bikram Sharma,Andrew Chang,Kristy Red-Horse.Annual Review of Physiology.2017

[2]Transcriptomic Profiling Maps Anatomically Patterned Subpopulations among Single Embryonic Cardiac Cells[J].Guang Li,Adele Xu,Sopheak Sim,James R.Priest,Xueying Tian,Tooba Khan,Thomas Quertermous,Bin Zhou,Philip S.Tsao,Stephen R.Quake,Sean M.Wu.Developmental Cell.2016(4)

[3]Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls[J].Hui Zhang,Wenjuan Pu,Guang Li,Xiuzhen Huang,Lingjuan He,Xueying Tian,Qiaozhen Liu,Libo Zhang,Sean M.Wu,Henry M.Sucov,Bin Zhou.Circulation Research.2016

[4]The CXCL12/CXCR4 Axis Plays a Critical Role in Coronary Artery Development[J].Sarah Ivins,Joel Chappell,Bertrand Vernay,Jenifer Suntharalingham,Alexandrine Martineau,Timothy J.Mohun,Peter J.Scambler.Developmental Cell.2015(4)

[5]刘向阳.心脏血管发育及畸形纠正的基础性研究[D].上海交通大学,2018.