超氧化物歧化酶的制备方法

背景及概述^[1]

超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)是一类氧化还原金属酶，能清除体内超氧自由基阴离子，有效地预防超氧自由基阴离子对机体的损害作用，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。SOD酶广泛分布于各种生物体内，如动物、植物、微生物等。

制备^[1-2]

报道一、

从蒜片加工废水中提取大蒜超氧化物歧化酶的方法：

以多个400目的不锈钢筛网为支撑材料，以200目的硅藻土为过滤介质，将硅藻土料液通过泵循环，预先在不锈钢筛网上均匀涂上5毫米厚的硅藻土过滤层，然后对10立方蒜片加工废水进行过滤，除去蒜片加工废水中的大颗粒杂质和胶体物质；对过滤后的蒜片加工废水打入反应釜，加热到75℃，加热时间20分钟，使蒜片加工废水中的杂蛋白变性絮凝，冷却至30℃，再经硅藻土挂膜过滤后，去除蒜片加工废水中的杂蛋白质；然后将蒜片加工废水经过滤澄清后，用泵打入装有1000公斤超氧化物歧化酶(SOD)分子印迹树脂的树脂柱，控制进样流速500立升/小时，选择性吸附废水中的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)，大蒜多糖等杂质随废水流出，实现了大蒜超氧化物歧化酶(SOD)与大蒜多糖等杂质的分离；超氧化物歧化酶(SOD)分子印迹树脂吸附饱和后，先用0.5立方去离子水冲洗树脂，然后用200公斤洗脱剂洗脱，控制洗脱流速100立升/小时，收集到含大蒜超氧化物歧化酶(SOD)的洗脱液250公斤；洗脱液经截留分子量20000的聚砜膜浓缩至固体质量百分比含量5％的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)浓缩液50公斤；将质量百分比含量5％的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)浓缩液，经-55℃的低温冷冻干燥10小时后，得到粉状大蒜超氧化物歧化酶(SOD)3公斤。

大蒜超氧化物歧化酶(SOD)提取率0.05％，大蒜超氧化物歧化酶(SOD)的酶比活性2670U/mg。

报道二、

一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于步骤如下：

(1)利用超声破碎仪破碎细菌发酵培养液(功率30％，开5s，停3s，破碎1h)，12000rpm离心40min，取上清，用盐酸调节溶液pH＝5.0，4℃静置1h后，12000rpm离心40min后取上清，在压力为0.5Mpa下，用截留分子量为3KDa的超滤膜，将上清浓缩至30mg/mL；

(2)将沉淀剂溶解在0.1mM，pH3.0的柠檬酸溶液中，配制成40mg/mL的PEG8000沉淀剂溶液，按1:1的体积比加入到步骤(1)中的蛋白溶液中，混合均匀后加入200uL的籽晶，置于4℃控温箱中搅拌结晶，搅拌速度为200rpm；

(3)将步骤(2)结晶完成后的溶液4℃、12000rpm离心30min取沉淀，所得沉淀即为超氧化物歧化酶晶体混合物；

(4)在步骤(3)中所得的溶液中加入40mg/mL的PEG8000溶液，缓慢搅拌混匀后，离心弃上清，重复该过程三次以彻底清洗晶体。

(5)以相同的结晶条件，结晶方法，重复结晶两次以上，以得到更高纯度的超氧化物歧化酶晶体。

(6)将步骤(5)所得晶体溶液冷冻干燥，得到超氧化物歧化酶纯度为95％，比活力为4335U/mg。

参考文献

[1][中国发明,中国发明授权]CN202010360991.X超氧化物歧化酶及其制备方法、超氧化物歧化酶口服液和固体制剂

[2][中国发明]CN201810289241.0一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法