三胜肽的制备和应用

背景及概述^[1]

三胜肽(GHK)是由甘氨酰、L-组氨酰与L-赖氨酸连接而成的一种天然三肽化合物(Gly-L-His-L-Lys)，其分子式为C14H24N6O4、分子量为340，三胜肽能与等当量铜有效络合而生成铜胜肽。铜是生物体内重要元素，它参与细胞呼吸作用、生物体内抗氧化、解毒、凝血、黑色素以及结缔组织的生成等等重要的生理功能；三胜肽能通过有效络合、转运铜元素而发挥相应的作用，譬如络合的铜胜肽能有效刺激成纤维细胞(fibroblasts)内胶原蛋白的生物合成，从而促进伤口的快速愈合；铜胜肽还能有效阻止乙醯胆碱物质的神经传导，从而具有放松肌肉，改善动态性皱纹等功效。三胜肽现被广泛应用于化妆品添加剂。

制备^[1]

催化制备三胜肽(GHS，HKS，PPK，ADK组合)

以ATCC购买的大肠杆菌(Escherichia coli K12)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae ATCC 204508)以及保氏杆菌(Paenarthrobacter aurescens TC1)染色体为模板用上述对应引物PCR扩增出ADK，gshB以及PPK基因片段，然后利用NEB公司购买的Nde I/Xho I进行相应的酶切，并连接到相同切点的pET28a质粒上(购于Addgene)，最后进行质粒转化(转入E coli Dh5a细胞，购于擎科生物)并菌落PCR及基因测序验证。La1基因片段是通过公司合成(安徽通用生物)并亚克隆到pET28a质粒上。最后以La1与gshB基因为模板，利用表2突变引物(常规的PCR扩增实现)构建多位点突变酶基因GHS与HKS。将上述构建到pET-28a载体上的GHS，HKS，PPK以及ADK质粒转入E.coli BL21(DE3)(购于安徽通用生物)菌株里，在37℃、5ml含50uM卡那霉素(Kanamycin)的LB培养液中进行小量培养，当细胞生长至OD0.5-0.8加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，37℃诱导蛋白表达3小时，最后收集细胞、冻融法进行细胞破碎、高速离心，收集到的上清液再利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认蛋白表达。蛋白表达正确的菌株逐级培养至5升发酵罐，在1.0mM IPTG条件下37℃诱导表达4小时，收集湿细胞近35-55克；最后将细胞与适量的Tris.HCl缓冲液(25mM，pH＝8.0)混合均匀后用高压破碎仪低温破碎，高速离心除去细胞壁后酶液保存在4℃冰箱备用。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。

在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中分别加入15克甘氨酸(200mM)，31克L-组氨酸(200mM)，29.2克L-赖氨酸(200mM)，5.6克三磷酸腺苷二钠盐ATP(10mM)，1.8克氯化镁(20mM)，3.75克氯化钾(20mM)以及51.6克多聚磷酸(Sigma，25聚，500mM单磷酸)，待pH值调节到8.0后；加入1000U的GHS酶液，1500U的HKS酶液，2000U的PPK以及1200U的ADK酶液。该反应体系在室温缓慢搅拌6小时(反应过程中通过添加HCl或NaOH水溶液维持体系pH值在6.5-9.0)后检测原料大部分消耗(利用ProFoldin公司L-组氨酸检测试剂盒检测反应液中残留的组氨酸原料)。最后通过调节反应液pH终止反应并沉底反应液中的蛋白(加酸调节溶液pH值到1.5后并快速搅拌)，过滤除去蛋白沉淀，随后将溶液调回pH值7.0；利用反渗透除盐，D201阴离子交换树酯除含磷酸杂质(用去离子水做洗脱液，三胜肽GHK由于与树脂结合能力弱直接流出)，冻干后甘氨酸-L-组氨酸-L-赖氨酸粗品通过纯水和乙醇1:(1-3)v/v结晶得到59克灰白色固体(收率87％，纯度96.0％)。

应用^[2-3]

应用一、

CN201910546288.5报道了一种含胜肽类口腔保健牙膏及其制备方法，包含三胜肽和四胜肽，具体包括三胜肽、四胜肽、摩擦剂、保湿剂、表面活性剂、增稠剂和水。本发明利用三胜肽即蓝铜胜肽具有抗氧化、抗炎、促进胶原增生、协助伤口愈合的功能以及四胜肽为己酰四肽-3具有消肿抗水肿，改善微循环，加强血液循环，促进溃疡愈合的功效，可用于防治口腔溃疡、咽喉肿痛、牙周炎、牙龈炎的同时能保持口腔清新卫生。

应用二、

CN201910296099.7报道了一种含牡丹抗氧化肽的牡丹香型面霜，按重量份含量计，包括以下组分：牡丹抗氧化肽13~17份、透明质酸3~6份、胶原蛋白1~2份、六胜肽2~4份、三胜肽3~8份、牡丹花精油2~4份、牡丹花浸提液0.5~1份、三乙醇胺0.1~0.4份、十六醇1~4份、单硬脂酸甘油酯6~8份，防腐剂1~3份；牡丹抗氧化肽具有较强的抗氧化性，通过络合铜离子，可以抑制酪氨酸酶的活性，防止黑色素的生成；三胜肽通过抑制酪氨酸酶的活性，能够抑制黑色素的生成，两者协同增效作用，使面霜具有较好的防晒功能；牡丹花精油和牡丹花浸提液含氨基酸和微量元素，能促进细胞再生，防止衰老，使面霜具有牡丹花香味，本发明面霜质地均匀、细腻，具有防晒、保湿、抗氧化、抗衰老的功效。

参考文献

[1] [中国发明] CN202011231194.8 一种突变酶及其应用和酶催化法制备三胜肽的工艺

[2] CN201910546288.5含胜肽类口腔保健牙膏及其制备方法

[3] CN201910296099.7一种含牡丹抗氧化肽的牡丹香型面霜及其制备方法