组氨酸标签蛋白染色试剂盒的应用

背景^[1-3]

组氨酸标签蛋白染色试剂盒是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。但传统的方法需要使用单链DNA模板，而得到单链DNA模板又需要先将基因克隆到类似M13这种载体中，操作过程冗长。

组氨酸标签蛋白染色试剂盒能够通过荧光染色来特异地检测聚丙烯酰胺凝胶中（例如，SDS-PAGE）含组氨酸标签的蛋白。使用该种染色试剂可以直接在胶上检测His标签融合蛋白的表达，而无需进行转膜和蛋白免疫印迹。虽然最低检出限依赖于所使用的紫外灯（300纳米）及检测仪器（是CCD照相机），但是该试剂盒是在过程之中评估组氨酸标签蛋白表达量的一种方便的方法，并且该试剂盒与后续的考马斯染料及其它总蛋白染色方法兼容。

组氨酸标签蛋白染色试剂盒特点：

1.比蛋白免疫印迹法快两到三倍，可以更快地得到结果并且节省珍贵的研究时间。

2.可直接在胶上检测，无需进行转膜和蛋白质免疫印迹却可以检测仅有0.2微克的6x组氨酸标签蛋白。

3.即用，含两种试剂配方–无需混合、无需稀释；确保了一种简单易行、操作无错误的检测方法。

4.用于单独、特异地检测6x组氨酸标签蛋白的荧光检测方法–检测您希望检测的目的蛋白(CCD照相方法可以检测到低丰度蛋白，UV透射方法可以检测大

量的标签蛋白)。

5.与各种蓝色染色试剂兼容，可以特异染色6x组氨酸标签蛋白并且可在此后利用蓝色染色试剂进行总蛋白染色。

应用^[4][5]

用于亚氨基二乙酸修饰的共轭聚合物荧光标记组氨酸标签蛋白研究

设计并合成了以聚撑苯乙炔为主链,在侧链中引入IDA的负电荷共轭聚电解质PPEIDA,并对其进行了如下具体研究:（1）对其与金属离子相互作用进行了分析,在甲醇溶液中金属离子对PPEIDA的淬灭效率要远高于在水溶液中,这是一个反常而有趣的现象,也正因为在水溶液在镍离子对PPEIDA的淬灭效率并不高,我们可以进一步利用依然保持较强荧光的PPEIDA与镍离子的络合物进行接下来的实验。

（2）利用FA和FRET验证了PPEIDA-Ni2+-His-Protein体系的可行性。FA实验中,PPEIDA溶液只有在有镍离子存在时加入带有组氨酸标签的蛋白才会有荧光各向异性的升高,镍离子或者组氨酸标签的缺席都不能使各向异性有所改变;FRET实验中,也只有在镍离子和组氨酸标签同时存在时,PPEIDA才能向组氨酸标签红色荧光蛋白进行荧光共振能量转移。FA和FRET实验均说明了镍离子以及组氨酸标签对于此体系生效的不可或缺性。

（3）实际应用PPEIDA-Ni2+-His-Protein体系。在Western Blot实验中利用PPEIDA与镍离子络合物替代一抗和二抗对组氨酸标签蛋白进行成像,省去了众多繁复的步骤,且不再依赖于专门的显影设备,大大节省了Western Blot实验的时间和成本。进一步的,我们还将此体系运用至细胞成像,成功地用PPEIDA与的镍离子络合物荧光成像Hela细胞表面的组氨酸标签蛋白。

参考文献

[1]Design of a binuclear Ni（II）–iminodiacetic acid（IDA）complex for selective recognition and covalent labeling of His-tag fused proteins[J].Ikuko Takahira,Hirokazu Fuchida,Shigekazu Tabata,Naoya Shindo,Shohei Uchinomiya,Itaru Hamachi,Akio Ojida.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters.2014(13)

[2]A Molecular Brush Approach to Enhance Quantum Yield and Suppress Nonspecific Interactions of Conjugated Polyelectrolyte for Targeted Far‐Red/Near‐Infrared Fluorescence Cell Imaging[J].Kan‐YiPu,KaiLi,BinLiu.Adv.Funct.Mater..2010(17)

[3]Conjugated polyelectrolytes as fluorescent sensors[J].Yan Liu,Katsu Ogawa,Kirk S.Schanze.Journal of Photochemistry&Photobiology,C:Photochemistry Reviews.2009(4)

[4]Oligohis‐tags:mechanisms of binding to Ni2+‐NTA surfaces[J].StevenKnecht,DanielRicklin,Alex N.Eberle,BeatErnst.J.Mol.Recognit..2009(4)

[5]蔡恺.亚氨基二乙酸修饰的共轭聚合物荧光标记组氨酸标签蛋白[D].清华大学,2017.