人多酚氧化酶(PPO)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人多酚氧化酶(PPO)ELISA试剂盒运用双抗体夹心ELISA酶联免疫法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体样本中PCDH1含量。

原理：已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

人多酚氧化酶(PPO)ELISA试剂盒操作步骤

1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9）在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于多酚氧化酶催化鸡蛋卵白蛋白交联对其结构与功能性质的影响研究

采用不同温度、时间的加热方式,添加化学试剂的方法使OVA变性;利用双孢蘑菇多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）对变性的OVA进行催化交联。

通过SDS-PAGE电泳及紫外分光光谱法对交联条件进行筛选,寻找的交联反应条件;利用光谱学方法表征OVA样品的结构;采用SDS-PAGE方法评估不同OVA样品的体外模拟胃肠消化性;利用竞争ELISA和人外周血嗜碱性粒细胞KU812体外细胞模型,评估OVA致敏性的变化;并对交联前后OVA的加工功能特性分析评定。

研究的主要方法、结果以及结论如下。1.利用SDS-PAGE电泳和紫外光谱,确定了OVA变性辅助交联的条件:1.0 mg/m L的OVA样品100μL,pH 7.0条件下,两种变性处理参数分别为:热变性为100℃水浴加热5min;化学变性为加入0.5%SDS于50℃水浴1 h;不同变性处理后的OVA样品分别加入PPO,使体系中酶活为1000 U/m L,50℃恒温水浴锅交联8 h。OVA样品共6组:天然OVA（N-OVA）,100℃-5min热处理OVA（H-OVA）,0.5%SDS变性OVA（SDS-OVA）;天然OVA交联产物（CL-OVA）,100℃-5min热处理辅助PPO催化OVA交联产物（CL-H-OVA）,0.5%SDS变性辅助PPO催化OVA交联产物（CL-SDS-OVA）。

2. 利用高效体积排阻色谱、圆二色光谱及ANS荧光光谱表征OVA样品结构的变化。以N-OVA为对照,其余OVA样品的二级结构均发生改变。其中,H-OVA发生热聚合,分子量增大,表面疏水性增加;SDS-OVA分子量无明显改变,表面疏水性增加;CL-H-OVA和CL-SDS-OVA组OVA分子有不同程度的聚合,表面疏水性降低,但仍高于N-OVA表面疏水性。

3. 通过体外模拟胃肠消化,评价不同OVA样品的消化性。只有N-OVA不易被胃肠消化,经变性和变性辅助交联的OVA样品均利于胃肠消化,可显著提高OVA的消化速率。

4.利用竞争ELISA检测不同OVA样品及其胃肠消化产物的IgG和IgE结合能力。在所有的样品中,CL-H-OVA及其胃肠消化产物的IgG和Ig E结合能力最低,表明热辅助PPO交联OVA降低其过敏原特性的效果最显著。

参考文献

[1]Cross-linked ovalbumin catalyzed by polyphenol oxidase:Preparation,structure and potential allergenicity[J].Ke Liu,Shuguang Chen,Hongbing Chen,Ping Tong,Jinyan Gao.International Journal of Biological Macromolecule.2018

[2]Caffeic acid-assisted cross-linking catalyzed by polyphenol oxidase decreases the allergenicity of ovalbumin in a Balb/c mouse model[J].Ping Tong,Shuguang Chen,Jinyan Gao,Xin Li,Zhihua Wu,Anshu Yang,Juanli Yuan,Hongbing Chen.Food and Chemical Toxicology.2018

[3]Sodium dodecyl sulphate（SDS）induced changes in propensity and kinetics ofα-lactalbumin fibrillation[J].E.Kiran Kumar,Shamsul Qumar,N.Prakash Prabhu.International Journal of Biological Macromolecule.2015

[4]Prevalence of common food allergies in Europe:a systematic review and meta‐analysis[J].B.I.Nwaru,L.Hickstein,S.S.Panesar,G.Roberts,A.Muraro,A.Sheikh.Allergy.2014(8)

[5]刘珂.多酚氧化酶催化鸡蛋卵白蛋白交联对其结构与功能性质的影响[D].南昌大学,2018.