溶菌酶抗体的应用

背景^[1-3]

溶菌酶抗体是一类可以特异性结合溶菌酶蛋白的多克隆抗体，主要用于体外检测溶菌酶的免疫实验。

溶菌酶是中性粒细胞颗粒中的一种葡萄糖苷酶，存在于泪腺、唾液、鼻分泌物之中，由于其具有抗菌活性可保护机体免遭入侵细菌的破坏。抗溶菌酶抗体属于中性粒细胞胞浆抗体，其靶抗原由嗜天青颗粒和特异性颗粒中的蛋白质成分所组成的杀微生物酶，但阳性率不高，缺乏疾病特异性。

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶是一种碱性球蛋白,专门作用于微生物细胞壁的水解酶,称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4键,从而破坏细菌的细胞壁,使之松驰而失去对细胞的保护作用,最终使细菌溶解死亡。

溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

应用^[4][5]

用于抗溶菌酶独特型抗体的制备及性质研究

以溶菌酶抑制性纳米抗体NBL42为抗原，对已经构建好的新疆双峰驼免疫噬菌体展示文库进行亲和淘洗筛选，期望获得具有溶菌酶活性的抗溶菌酶独特型抗体，为抗体酶的研究和纳米抗体的分子模拟机制研究提供线索。

通过辅助噬菌体滴度的测定，确定抗体库噬菌体滴度。BLAST和DNAMAN软件分析溶菌酶抑制性单域抗体NBL42、NBL114的氨基酸序列。对包含NBL42、NBL114的大肠杆菌宿主菌BL21经过IPTG诱导表达NBL42、NBL114。采用Ni-Sepharose4B亲和层析纯化带His标签的抗体蛋白。SDS-PAGE鉴定纯度，对NBL42、NBL114抗原溶菌酶结合能力采用ELISA进行测定。

分别应用NBL42和NBL114作为抗原,对本实验室已经构建好的VHH抗体免疫文库中进行筛选,利用IgG3VHH序列上下游特异引物进行菌落PCR鉴定VHH阳性克隆。引物序列如下VHH-P1:5′-CGCGGATCCGTCCTGGCTGCTCTTCTAC-3′,下游引物VHH-P2:5′-CCGCTCGAGCTTGCATACTTCATTCGTTTC-3′和带有c-Myc标签的引物VHH-P3-IgG3-M:5’-CCGCTCGAGATTCAAGTCCTCTTCAGAAATGAGCTTTTGCTCTGAGGAGAC-3’。

阳性克隆经测序证实为VHH抗体后，亚克隆到pET30a构建原核表达载体，诱导表达纯化。SDS-PAGE和Western blot检测纯化的抗体的纯度。ELISA检测与NBL42的特异结合。

溶菌酶活性测定采用大肠杆菌进行抑菌检测吸光值的降低。酶活力单位定义为特定条件下，每分钟使吸光度值OD450降低0.001为1个酶活力单位。经测定，辅助噬菌体M13K07滴度为1.24×1013pfu/mL，新疆双峰驼免疫文库噬菌体经一轮扩增后滴度为1.46×1013pfu/mL。成功表达纯化得到溶菌酶抑制性抗体NBL42、NBL114。

参考文献

[1]Improved production and function of llama heavy chain antibody fragments by molecular evolution.Van der Linden RH,De Geus B,Frenken GJ,et al.Journal of Biotechnology.2000

[2]MolecμLar basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chainantibodies.De Genst E,Silence K,Decanniere K,Conrath K,Loris R,Kinne J,Muyldermans S,WynsL.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2006

[3]Naturally occurring antibodies devoid of light chains.Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,et al.Nature.1993

[4]High expression and purification of the recombinant camelid anti-MUC1 single domain antibodies in Escherichia coli.Rahbarizadeh F,Rasaee MJ,Forouzandeh-Moghadam M,et al.Protein Expression and Purification.2005

[5]克力比努尔·热合曼.抗溶菌酶独特型抗体的制备及性质研究[D].新疆大学,2012.