考马斯亮蓝染色试剂盒(常规法)

背景^[1-3]

考马斯亮蓝染色试剂盒(常规法)采用了最经典的考马斯亮蓝染色和脱色方法，以考马斯亮蓝R250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳凝胶的常规染色和脱色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。

使用考马斯亮蓝染色试剂盒，采用常规染色脱色方法累计时间达到2-3小时后可以观察到蛋白条带；采用快速染色脱色方法20分钟左右即可观察到蛋白条带。观察到最清晰的蛋白条带则需染色脱色更长时间。

考马斯亮蓝染色试剂盒中的染色液和脱色液经过改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性气味的乙酸。

使用方法：

1.电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。

2.置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。

3.倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。

4.加入适量脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。

5.置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。

6．完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。

应用^[4][5]

用于骨炎定对体外培养软骨细胞的影响研究

采用软骨细胞培养技术观察其对软骨细胞代谢的影响。

关节软骨细胞的分离和培养采用胶原酶Ⅱ分段酶消化法从三月龄大耳白兔的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况，并用甲苯胺蓝异染色法进行细胞表型鉴定。

结果表明，软骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右，传代培养约4-5天，细胞以圆形或上皮样细胞形态为主。甲苯胺蓝染色证实，细胞可合成蛋白多糖，异染反应主要集中在细胞集落样生长区，异染程度以原代培养最为显著。

骨炎定对培养兔软骨细胞增殖和蛋白质合成的影响把传一代的软骨细胞接种于96孔培养板和24孔培养板中，培养24小时后细胞贴壁进行分组试验。

1 MTT法测细胞增殖把96孔培养板中的32孔随机分为8组，每组4孔，每孔培养体积0.1ml。A组（对照组）加用5％血清培养液；B-G组：分别加用含有5％血清与1.25％、2.5％、5％、10％、20％、40％DMEM培养液；AO组为空白调零组，未接种细胞，只加有含有5％血清的DMEM在培养48小时后用MIT ie检测细胞活性和增殖。结果GYD组5O、10o、20％骨炎定可促进软骨细胞增殖，与对照组相比，差别有非常显著意义。

2考马斯亮蓝祛检测细胞总蛋白24孔培养板随机分为六组，每组4孔，分别为：A组：空白对照组。只加含有5％血清培养液；BS组分别加含有20％、10％、5％骨炎定、5％防风、5％当归注射液的培养液，培养三天后用考马斯亮蓝法检测细胞总蛋白。结果表明：5％、10％、20％可促进软骨细胞总蛋白合成，与对照组相比差别有非常显著性意义。

参考文献

[1]Osteogenic protein-1（OP-1）blocks cartilage damage caused by fibronectin fragments and promotes repair by enhancing proteoglycan synthesis[J].H.E.Koepp,K.T.Sampath,K.E.Kuettner,G.A.Homandberg.Inflammation Research.1999(4)

[2]Microgravity tissue engineering[J].Lisa E.Freed,Gordana Vunjak-Novakovic.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Animal.1997(5)

[3]Differentiation and mineralization in chick chondrocytes maintained in a high cell density culture:A model for endochondral ossification[J].Colin Farquharson,Colin C.Whitehead.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Animal.1995(4)

[4]1992 ALZA distinguished lecture:Bioengineering and vascular biology[J].Larry V.McIntire.Annals of Biomedical Engineering.1994(1)

[5]杨运东.骨炎定对体外培养软骨细胞的影响[D].广州中医药大学,2001.