人血管内皮细胞生长因子(VEGF)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人血管内皮细胞生长因子(VEGF)ELISA KIT应用间接法测定标本中人血管内皮细胞生长因子(VEGF)水平。

用纯化的人血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入已知浓度的血管内皮细胞生长因子(VEGF)标准品和未知浓度的血管内皮细胞生长因子(VEGF)待检样品，温育后，加入生物素标记的抗IgG抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血管内皮细胞生长因子(VEGF)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人血管内皮细胞生长因子(VEGF)浓度。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），又称血管通透因子（vascular permeability factor，VPF）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。

血管内皮生长因子是一个家族，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子（PGF）。

通常VEGF即VEGF-A。VEGF-A可促进新生血管形成和使血管通透性增加，VEGF-B在非新生血管形成的肿瘤中起作用，VEGF-C和VEGF-D在癌组织的新生血管和新生淋巴管的形成过程中起作用，VEGF-E也是一种潜在的新生血管形成因子，PGF促进新生血管形成，使血管通透性增加，在实验性脉络膜新生血管中PGF的表达明显增高。

应用^[4][5]

用于灵芝多糖对LA795肺癌细胞分泌VEGF、TGF-β1、IL-10的影响研究

选用LA795肺癌细胞，探讨灵芝多糖对这种肿瘤细胞分泌免疫抑制分子的影响，拓展对灵芝多糖抗肿瘤机制的认识，为肺癌的免疫治疗提供新思路。

方法：

1. 细胞来源：本实验采用的LA795细胞是一种来源于小鼠的肺腺癌细胞系。

2.实验分组及干预：实验依据培养LA795肺癌细胞的RPMI-1640完全培养基中所含灵芝多糖浓度不同进行分组，设0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml五个实验组，以完全培养基为空白对照。

3. 采用免疫ELISA方法，检测各组细胞VEGF、TGF-β1、IL-10因子的表达情况。4.采用RT-qPCR技术，检测各组细胞VEGF、TGF-β1、IL-10在基因转录水平的表达差异。

5.数据统计分析：应用SPSS17.0统计学软件，对结果进行单因素方差分析，p<0.05表示差异有统计学意义。

结果：从表达量和基因水平检测灵芝多糖对LA795肺腺癌细胞分泌VEGF的影响：在不同浓度灵芝多糖（0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml）作用下，各组LA795肺癌细胞连续培养48h。

应用ELISA技术检测显示，LA795肺癌细胞培养上清中VEGF表达水平分别为147.98±0.28、120.25±14.24、103.11±10.57、91.27±13.62、84.66±10.41，以空白对照组的VEGF的表达水平最高，随灵芝多糖浓度的不断增高，LA795肺癌细胞VEGF表达水平逐渐降低。经单因素方差分析，差异有显著性（F=15.912，P<0.005）。0μg/ml组与0.2μg/ml组、0.8μg/ml组、3.2μg/ml组、12.8μg/ml组之间比较,差异均有显著性（P<0.05）。

应用RT-qPCR技术检测显示,LA795肺癌细胞VEGF mRNA的表达水平分别为1.00±0.00、0.67±0.24、0.68±0.24、0.48±0.21、0.50±0.23，以空白对照组的VEGF mRNA的表达水平最高，应用灵芝多糖浓度后，LA795肺癌细胞VEGF mRNA表达水平降低。

经单因素方差分析，差异有显著性（F=3.034，P<0.1）。0μg/ml组与3.2μg/ml组、12.8μg/ml组之间比较，差异有显著性（P<0.05）。结果显示灵芝多糖可抑制LA795肺癌细胞VEGF基因转录。

参考文献

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[2]Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer[J].Minu K Srivastava,Å,sa Andersson,Li Zhu,Marni Harris-White,Jay M Lee,Steven Dubinett,Sherven Sharma.Immunotherapy.2012(3)

[3]IL‐10 production in non–small cell lung carcinoma patients is regulated by ERK,P38 and COX‐2[J].SwatiPatel,ShamalVetale,PradeepTeli,RajeshMistry,ShubhadaChiplunkar.Journal of Cellular and Molecular Medicine.2012(3)

[4]A novel polysaccharide from Se-enriched Ganoderma lucidum induces apoptosisof human breast cancer cells[J].Dejing Shang,Yang Li,Che Wang,Xiaomin Wang,Zhi Yu,Xin Fu.Oncology Reports.2011(1)

[5]李娜.灵芝多糖对LA795肺癌细胞分泌VEGF、TGF-β1、IL-10的影响[D].承德医学院,2014.