狗肾细胞的应用

背景^[1-3]

狗肾细胞是从一只外观正常的成年雌性英国小猎犬的肾分离等到MDCK细胞株。角蛋白免疫过氧化物酶染色呈阳性。MDCK被用于研究β-粥样蛋白前体的处理及其蛋白水解产物。

操作说明：

1)对于常温运输的细胞，收到细胞后，检查是否有运输问题，即细胞培养瓶或管是否破损，细胞培养液是否溢出。若没有运输问题，请75%酒精消毒后，保留封口膜，放入细胞培养箱中静置。严格检查培养箱的参数：温度，湿度和CO2浓度。细胞静置时间一般为6-12小时后，细胞状态稳定后，即可开始后续操作。选用正确的细胞培养体系，A2780(人卵巢癌细胞)严格按照说明书的培养条件进行培养。条件允许，培养的前三天内做细胞拍照记录，通过邮件发送给我们做及时状态跟踪。

2) 对于干冰运输的细胞，请取出冷冻管后，须立即放入37C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。然后将其复苏培养，次日更换培养液。

传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

4.移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。

应用^[4][5]

用于犬瘟热病毒Lederle株H、N基因的克隆、序列分析及表达研究

犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)可感染犬科(尤其是幼犬)、鼬科、大熊猫科、猫科、浣熊科等多种动物，引起高发性、致死性传染病。CDV是单股负链RNA病毒，在分类学上属于副粘病毒科，麻疹病毒属。

CDV基因组按3’至5’端顺序依次为N-P-M-F-H-L基因序列，基因组长约16kb，分别编码N、P、M、F、H和L这六种蛋白。H、N蛋白在犬瘟热的免疫预防方面起重要作用。本研究在对犬瘟热流行状况初步检测与分析的基础上，以CDV Lederle株H、N基因作为研究对象，进行序列测定与分析，然后将其克隆到大肠杆菌中诱导表达。

获得了大量易于纯化的具有良好抗原性的H和N蛋白，为利用重组蛋白建立敏感特异的犬瘟热ELISA诊断方法打下基础，为该病毒株的进一步研究和犬瘟热诊断试剂的研制等打下基础。

利用RT-PCR技术直接检测病犬粪便中的CDV抗原，并对检测结果进行分析，结果显示检测样品阳性率为18.7％，检测结果还揭示了年龄及免疫情况与发病率的相关性，统计发现未成年幼犬更容易被感染，接种过犬瘟热疫苗的犬仍有很高的感染率。

犬瘟热病毒Lederle株分别在非洲绿猴肾细胞(Vero)、狗肾细胞(DK)及鸡胚成纤维细胞(CEF)上培养。前两种细胞盲传到第8代均没有出现细胞病变(CPE)，在CEF上盲传三代后出现细胞变圆、拉网，脱壁等明显细胞病变特征，获得了细胞适应株。

参考文献

[1]Comparison of Immunoperoxidase Plaque Staining and Neutralizing Tests for Canine Distemper Virus[J].T.Soma,H.Ishii,M.Hara,S.Yamamoto,T.Yoshida,T.Kinoshita,K.Nomura.Veterinary Research Communications.2001(4)

[2]In vivo and in vitro expression of canine distemper viral proteins in dogs and non-domestic carnivores[J].Archives of Virology.1993(3)

[3]Antigenic relationships between field isolates of morbilliviruses from different carnivores[J].Archives of Virology.1992(3)

[4]犬瘟热病毒当前研究进展[J].许莎琼,朱建国,傅志强,吴祖立,华修国.上海畜牧兽医通讯.2006(01)

[5]杨应丽.犬瘟热病毒Lederle株H、N基因的克隆、序列分析及表达[D].首都师范大学,2007.