谷胱甘肽还原酶的制备

发布日期:2020/9/24 9:27:24

背景及概述^[1]

谷胱甘肽还原酶可以还原氧化型谷胱甘肽(GSSG)生成还原型谷胱甘肽(GSH)。谷胱甘肽还原酶在许多组织中都有分布，可以维持细胞内充足的还原型谷胱甘肽(GSH)水平，GSH可以清除自由基和一些有机过氧化物，或作为谷胱甘肽氧化酶(Glutathioneperoxidase)的底物来清除一些过氧化物。

嗜冷谷胱甘肽还原酶制备^[2]

该嗜冷谷胱甘肽还原酶，(1)由2个相同的亚基构成，亚基的表观分子量为54.6kDa，总分子量为105kDa；(2)动力学参数表观米氏常数Km还原辅酶IINADPH、Km氧化型谷胱甘肽GSSG、Km还原辅酶INADH分别为23.3μmol/L、66.0μmol/L、83.8μmol/L；(3)最适pH为7.5，强碱性对其活性影响比较大；(4)最适温度为25℃，属于一种低温酶或嗜冷酶，在0℃还具有一定的活力；对高温具有不稳定性，与低温酶相同；活化能为3.7kJ/(mol·K)，-78℃保藏是的保藏方法；(5)最适Mg2+为7.5mmol/L，Ca2+、Mg2+对其活性具有促进作用；(6)螯合剂EDTA乙二醇-双(2-氨基乙基)四乙酸等、重金属离子如Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等不同程度地抑制其活力。制备方法如下：

酶液的初提：

谷胱甘肽还原酶纯化的操作均在4℃进行。将冷冻干燥的南极微藻称重，共20g，加石英砂和液氮研磨数次后，加入4倍约80ml的酶提取液(含0.1mol/LpH7.8的磷酸钾盐缓冲液，5mmol/L谷胱甘肽、1mmol/LEDTA、0.1mmol/LDDT、1％PVP聚乙烯吡咯烷酮)，反复冻融3次，四层纱布过滤；含脂类较多时使用0.22μm滤膜抽滤除脂；然后以14000转/分钟的转速离心15分钟，除去不溶性淀粉，上清液再以11000转/分钟的转速离心15分钟，弃沉淀，保留上清液。上清液在酶提取液中透析2天，透析期间更换缓冲液数次。

硫酸铵沉淀：

将透析过的含谷胱甘肽还原酶的上清液，先用量筒量好体积，缓慢逐步加入硫酸铵至40％饱和度，在冰浴中进行，边加边搅拌。加完后用浓氨水调pH至7.0，再继续搅拌2小时，不要起泡；以12000转/分钟的转速离心20分钟，取上清液继续加入硫酸铵至90％饱和度，边加边搅拌，浓氨水调pH至6.0左右，置于冰箱中过夜；同样转速离心，将沉淀悬于40ml酶提取液，重复上面步骤再沉淀1次，最终沉淀溶于离子交换平衡缓冲液(缓冲液A，含50mmol/LpH7.8的磷酸钾盐缓冲液，5mmol/L谷胱甘肽、1mmol/LEDTA、0.1mmol/LDDT)，且对缓冲液A透析2天。

离子交换层析：

填料用二乙基葡聚糖凝胶DEAESephadexA50；先用平衡缓冲液平衡；上样后，用平衡缓冲液洗涤，再用氯化钾梯度洗脱，分部收集。

亲和层析：

将离子交换的收集样在缓冲液C(50mmol/LpH7.8的磷酸钾盐缓冲液，含0.1mol/LKCl、1mmol/LEDTA、0.1mmol/LDDT)透析浓缩后，进行亲和层析。称取1.5g2’，5’-ADPSepharose4B溶胀后装柱，柱大小为0.9cm×5cm，用缓冲液C平衡过夜，上样总蛋白为1.5mg，用缓冲液C洗柱至吸光度OD280nm小于0.02为止。然后用含5mmol/L的NADP+的缓冲液C进行洗脱，流速为0.25ml/分钟，每1ml/管收集，分别测定蛋白质吸收值和谷胱甘肽还原酶相对活力。将具有酶活力的管收集在一起，并测定酶的相对活力、蛋白质含量和总体积。柱的再生用含0.5mol/L氯化钾KCl、pH8.5的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸Tris-HCl和含0.5mol/LKCl、pH4.5的乙酸钠缓冲液交替反复洗脱3次，每次洗脱约2-3倍柱体积。

凝胶过滤：

填料为葡聚糖凝胶SephadexG-200，上样后，用50mmol/LpH7.8的磷酸钾盐缓冲液洗脱，洗脱流速成为0.25ml/分钟，按2.5ml/管分部收集。