ANTI-CDC34的应用

背景^[1-3]

ANTI-CDC34是ANTI-CDC34为抗原制得的免疫抗体，可以特异性结合CDC34。主要用于检测CDC34的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多种免疫学实验。

在人类基因组编码两个E1酶，至少38种E2酶，以及超过600种不同E3酶，其中的每一个具有潜力来识别多个基板。的E3酶家族，cullin-RING连接酶（CRLs），最初被发现为多亚基Skp1-Cdc53/Cullin-F盒蛋白（SCF）泛素连接酶。SCF复合物包含核心亚基Skp1，Cdc53/Cul1和Rbx1/Roc1/Hrt1以及一组称为F box蛋白的衔接子亚基，其通常以磷酸化依赖性方式募集特定底物至核心复合物。

至于所有人RING结构域E3酶，SCF复合物捕获底物用于E2介导的遍在蛋白化，但本身不具有催化活性。基于类似的衔接子-cullin-RING结构构建的SCF样复合物包括促进复合物/环状体的后期和基于Cul2-，Cul3-，Cul4A-，Cul5-和Cul6-的泛素连接酶。因此，CRL类具有靶向数百种（如果不是数千种）蛋白质降解的能力。CDC34（细胞分裂周期34）是蛋白质编码基因。

其相关途径包括TCR信号传导（REACTOME）和CLEC7A（Dectin-1）信号传导。与该基因相关的基因本体论（GO）注释包括连接酶活性和遍在蛋白连接酶结合。CDC34在控制细胞周期和DNA复制中很重要。与不同的E3复合物（包括SCF）相关的Cdc34已经显示出在细胞分裂，信号转导和发育过程中靶向许多不同的底物以进行泛素化和降解。

已经表征的Cdc34底物包括IκB，B-Myb，Wee1，MyoD，ICERIIα，ATF5，p27Xic1和p27Kip1。另外，由于它们对蛋白水解的SCF要求，诸如β-连环蛋白，p21Cip1，E2F，细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白D的底物是Cdc34的推定底物。已经证明Cdc34通过C末端的结构域自缔合，并且在体内被磷酸化和泛素化。该蛋白质可用于体外泛素化反应。

应用^[4][5]

用于CDC34活性半胱氨酸对自身稳定性的调控及CDC34相互作用蛋白的鉴定与功能研究

把CDC34的活性位点93位的半胱氨酸进行了点突变,探索了突变体对其自身泛素化和稳定性的影响,使用野生型和突变体来纯化并用LC-MS/MS寻找CDC34相互作用蛋白,然后对这些蛋白进行了验证和相互调控关系的研究。

研究方法:构建带有Strep-FLAG标签的野生型CDC34以及突变型的CDC34 C93S质粒,在HEK293T细胞中表达CDC34野生型和突变体,蛋白免疫印迹在全蛋白中检测野生型和突变体的表达情况,检测活性位点突变对CDC34自身稳定性和泛素化的影响;

利用免疫沉淀的方法将与CDC34相互作用的蛋白进行纯化,然后利用银染检测差异相互作用蛋白、利用LC/MS-MS分析酶解后的多肽;通过蛋白质数据库(UniProt)搜索,筛选出在对照组、野生型以及突变型相互作用差异较大的蛋白,获得潜在的与CDC34相互作用的蛋白质,运用生物信息学的方法分析这些蛋白质的功能,并通过蛋白质印迹验证它们与CDC34的相互作用及调控关系。

研究结果:(1)CDC34C93S显著抑制了CDC34C93S自身的泛素化修饰,使其稳定性增加。(2)CDC34C93S突变体能增加部分相互作用蛋白的稳定性。(3)质谱分析鉴定到了MCM7、PRKDC、GNL3等与CDC34相作用的蛋白质,并且CDC34能上调MCM7的水平,下调GNL3的蛋白水平。

参考文献

[1]Ubiquitylation,neddylation and the DNA damage response[J].Jessica S.Brown,Stephen P.Jackson.Open Biology.2015(4)

[2]MCM7 serves as a prognostic marker in diffuse-type gastric adenocarcinomaand siRNA-mediated knockdown suppresses its oncogenic function[J].Wei Kang,Joanna Tong,Anthony Chan,Alfred Cheng,Jun Yu,Kafai To.Oncology Reports.2014(5)

[3]Ubiquitin-conjugating enzyme E2C:A potential cancer biomarker[J].Chanlu Xie,Chris Powell,Mu Yao,Jianmin Wu,Qihan Dong.International Journal of Biochemistry and Cell Biology.2014

[4]Molecular and structural insight into lysine selection on substrate and ubiquitin lysine 48 by the ubiquitin-conjugating enzyme Cdc34[J].Randy Suryadinata,Jessica K.Holien,George Yang,Michael W.Parker,Elena Papaleo,Boris Sarcevic.Cell Cycle.2013(11)

[5]刘勋.CDC34活性半胱氨酸对自身稳定性的调控及CDC34相互作用蛋白的鉴定与功能研究[D].苏州大学,2016.