活细胞核染色试剂盒的应用

背景^[1-3]

活细胞核染色试剂盒是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测试剂盒。CCK法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

检测原理：

CCK法是经典的周期检测方法。CCK为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。CCK染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

操作步骤

在96孔板中配制100μl的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5%CO2的条件下)。向培养板加入10μl不同浓度的待测物质。

将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6,12,24或48小时)。

向每孔加入10μl CCK8溶液（engreen）(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。

将培养板在培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加10μl0.1 M HCl溶液或者1%wSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

应用^[4][5]

用于转核技术建立可增殖神经细胞系的实验研究

将胎鼠皮质神经元细胞核转入到骨髓间充质干细胞胞质体中构建转核细胞,以期望建立一种可增殖的神经细胞系,为脑移植的供体细胞来源探索一条新的途径。

方法:(1)骨髓间充质干细胞的培养,用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志物CD44、CD90、CD71、CD11b进行鉴定,用免疫细胞化学染色法检测CD133的表达情况;

(2) 用梯度离心法制备骨髓间充质干细胞胞质体,并用HE染色、Giemsa染色、免疫荧光双标法、透射电镜检查等方法进行鉴定,用台盼蓝染色检测其活性;

(3) 采用胎龄17d的胎鼠进行皮质神经元的分离培养,用免疫组化法检测神经元MAP2和NeuN的表达情况;

(4) 用梯度离心法制备神经元细胞核,并用HE染色、免疫荧光染色、透射电镜检查等方法进行鉴定,用台盼蓝染色检测其活性;

(5) 用PEG介导神经元细胞核与骨髓间充质干细胞胞质体发生融合构建转核细胞;

(6) 用Hoechst33342和CD71免疫荧光双标法对转核细胞进行鉴定;

(7) 用抗BrdU和Hoechst33342免疫荧光双标法检测转核细胞是否具有增殖能力,用MTT比色法绘制生长曲线;

(8) 用扫描电镜和透射电镜对转核细胞进行检测;

(9) 用流式细胞仪检测转核细胞CD44、CD90、CD71、CD11b等抗原的表达变化;

(10) 用免疫荧光双标法和免疫细胞化学染色法检测转核细胞NeuN的表达情况;

(11)用免疫细胞化学染色法检测转核细胞CD133、MAP2、Nestin等抗原的表达情况;

参考文献

[1]Spontaneous expression of neural phenotype and NGF,TrkA,TrkB genes in marrow stromal cells[J].Na Li,Hui Yang,Lingling Lu,Chunli Duan,Chunli Zhao,Huanying Zhao.Biochemical and Biophysical Research Communications.2007(3)

[2]Neural differentiation potential of peripheral blood-and bone-marrow-derived precursor cells[J].Sangnyon Kim,Osamu Honmou,Kazunori Kato,Tadashi Nonaka,Kiyohiro Houkin,Hirufumi Hamada,Jeffery D.Kocsis.Brain Research.2006(1)

[3]Undifferentiated mouse mesenchymal stem cells spontaneously express neural and stem cell markers Oct-4 and Rex-1[J].Fmj Lamoury,J Croitoru-Lamoury,Bj Brew.Cytotherapy.2006(3)

[4]Development of embryos reconstructed by interspecies nuclear transfer of adult fibroblasts between buffalo(Bubalus bubalis)and cattle(Bos indicus)[J].Fenghua Lu,Deshun Shi,Jingwei Wei,Sufang Yang,Yingming Wei.Theriogenology.2005(6)

[5]周竹娟.转核技术建立可增殖神经细胞系的实验研究[D].第三军医大学,2007.